Студия 46: фото, отзывы, адрес, цены – Афиша-Рестораны

25 Фев

Содержание

Студия 54 — дата выхода в России и других странах — Кинопоиск

24 августа 1998 США
 
28 августа 1998 США
 
3 572 955 чел.
9 сентября 1998 Франция
Кинофестиваль в Довиле 
12 ноября 1998 Австралия
 
26 ноября 1998 Новая Зеландия
 
10 декабря 1998 Германия
 
77 235 чел.
10 декабря 1998 Израиль
 
11 декабря 1998 Швейцария
Немецкоговорящие регионы 
18 декабря 1998 Австрия
 
18 декабря 1998 Испания
 
499 138 чел.
18 декабря 1998 Турция
 
14 января 1999 Словакия
 
15 января 1999 Швеция
 
46 116 чел.
22 января 1999 Великобритания
 
44 785 чел.
12 февраля 1999 Греция
 
12 февраля 1999 Исландия
 
25 февраля 1999 Сингапур
 
8 апреля 1999 Нидерланды
 
4 586 чел.
9 апреля 1999 Финляндия
 
26 772 чел.
23 апреля 1999 Дания
 
9 784 чел.
23 апреля 1999 Колумбия
 
21 мая 1999 Норвегия
 
26 июня 1999 Япония
 
14 июля 1999 Франция
 
117 764 чел.
28 июля 1999 Бельгия
 
28 900 чел.
26 августа 1999 Венгрия
 
42 692 чел.
18 ноября 1999 Аргентина
 
19 ноября 1999 Италия
 
32 980 чел.
30 июня 2000 Польша
 
44 507 чел.
7 февраля 2015 Германия
Берлинский международный кинофестиваль 
6 марта 2015 Мексика
 
27 марта 2015 Великобритания
 
4 апреля 2015 Турция
 
24 апреля 2015 США
 
30 апреля 2015 США
 
29 мая 2015 США
 
2 июня 2015 США
 
7 июня 2015 США
 
13 июня 2015 Австралия
 
27 июня 2015 Великобритания
 
17 июля 2015 Новая Зеландия
Международный кинофестиваль в Новой Зеландии 
28 июля 2015 Польша
Международный кинофестиваль «Новые горизонты» 
2 октября 2015 Греция
Кинофестиваль в Афинах 
9 декабря 2015 Франция
 
14 января 2016 Германия
 
26 февраля 2016 Сербия
 
8 сентября 2016 Венгрия
 
28 сентября 2018 Сингапур
 

Студия 54 — кассовые сборы — Кинопоиск

Кассовые сборы
В США:

$16 757 163 

 

В других странах:

— 

 

Общие сборы:

$16 757 163 

 
 
 
Затраты
Бюджет:

$13 000 000 

 

Маркетинг:

— 

 

Итого:

$13 000 000 

 
 
 

Первый уик-энд (США)
Широкий прокат:

$6 611 532


39.

5% (% от сборов) 
Макс. кол-во кинотеатров:

1 869


* по данным boxofficemojo.com
 
Прокат (США)
Широкий прокат:

28.08.1998

(кинотеатров: 1 859, ~$3 556)
 

Кассовые сборы уик-эндов (США)

Первый уик-энд →

Видео записи выступлений вокалистов студии «ARTIST», видео клипы.

Видео записи выступлений вокалистов студии                             «АРТИСТ», видео клипы.

Песня «Мамина улыбка» муз.
и сл. Чубчик А.С.(РАО)

Студия Эстрадного Вокала «АРТИСТ» С Новым Годом 2018

ГИМН ВОКАЛЬНОЙ СТУДИИ АРТИСТ

Песня «Возмемся за руки друзья»  муз.
и сл.Чубчик А.С.(РАО)

Песня «Лето ла-ла»   Жукова Дарья

Студия эстрадного вокала АРТИСТ (г.
Курск) «О ДЕТЯХ»

ВИДЕО-РОЛИК АРТИСТ

Студия АРТИСТ «Попурри песен о России»

Союз творческих, весёлых, активных единомышленников

14 февр. 2022 г., 18:49

Участникам губернаторского проекта «Активное долголетие» скучать некогда. При желании они могут проводить в клубе практически весь день.

Утро здесь традиционно начинается с физзарядки, а потом есть выбор: хочешь – занимайся рукоделием, хочешь – танцуй, читай стихи, репетируй монологи, пой, играй в шахматы, осваивай скандинавскую ходьбу, участвуй в конкурсах. Занятий много – можно найти на свой вкус.

Здесь умеют принимать гостей. К примеру, недавно уже во второй раз к участникам губернаторского проекта «Активное долголетие» приходил поэт и художник Олег Ширяев. Активисты клуба познакомились с произведениями автора, которые наполнены светом и любовью к людям и миру.

Театральная студия клуба «Активное долголетие» под руководством Максима Кузьмина готовится к творческому вечеру «Снилось мне…» поэтессы Александры Боковой, который состоится 8 февраля. Сон как художественный образ часто встречается в произведениях Александры Боковой. Именно из счастливых снов автора и приходят многие прекрасные стихотворения, которые прозвучат на её творческом вечере.

Творческая коллаборация – сообщество единомышленников, активных, задорных, креативных, необыкновенно талантливых людей. Студия «Позитив» появилась в клубе недавно.

«На новогодние праздники студии «Четыре с хвостиком» (руководитель – участница клуба, серебряный волонтёр Татьяна Халилова) и «Подиум» подготовили целое театрализованное представление, – рассказывает руководитель клуба «Активное долголетие» Алевтина Хайлова. – А затем пришла идея организовать новую студию с прекрасным названием «Позитив».

Кстати, Татьяна Халилова – кинолог, дрессировщица, руководитель питомника миниатюрных собак «Х’ит Уллуз». Её четвероногие питомцы снимаются в фильмах. И она с удовольствием делится своими знаниями с активистами.

«Я с детства мечтала о собаке и о цирке, – рассказала Татьяна. – Окончила Тимирязевскую академию по специальности «зооинженер», курсы по дрессировке собак. Первых своих четвероногих питомцев подобрала на улице, обучила их разным трюкам. Организовала детскую студию «Мой друг». Моих собак пригласили сниматься в кино. А я стала выступать со своими питомцами в «Цирке на сцене».  Но если в детстве я мечтала просто о собаке, то после 40 лет хотела уже четвероногого друга определённой породы. Моя мечта осуществилась. Я стала заводчиком, а затем руководителем питомника, которому уже более 20 лет».

По словам Татьяны, у неё была ещё одна мечта – научиться танцевать. Она смогла её воплотить в реальность в клубе «Активное долголетие». В результате обрела много новых друзей, большинство из них, оказалось, любят животных, а у некоторых есть домашние питомцы. И сегодня Татьяна делится секретами своего мастерства и готовит яркие выступления.

«Репетиции занимают достаточно много времени», – рассказала Татьяна Халилова. – Мы вышли за рамки студии «Четыре с хвостиком», поэтому решили организовать новую студию, в которой собрались талантливые, креативные и жизнерадостные люди. Название сложилось само собой – «Позитив». Сейчас мы готовим новый проект к 8 Марта – представление под названием «Мечты сбываются». В нашем выступлении будут участвовать не только дрессированные собачки. Мы включили и другие жанры эстрадно-циркового искусства. Ну, а как у нас это получится, вы можете увидеть сами. Ждём всех в клубе «Активное долголетие» 3 марта!».

Клуб «Активное долголетие» открыт для женщин 55+ и мужчин 60+. Занятия проходят бесплатно, без предварительной записи. С расписанием занятий можно ознакомиться на страницах клуба в социальных сетях.

Запись в клуб осуществляется по телефону: 8(916)975-12-46.или по адресу: ул. Мира, д. 37. График работы клуба – понедельник–пятница с 10.00 до 19.00. Суббота, воскресенье – выходные дни.

Источник: http://inmytishchi.ru/novosti/kultura/soyuz-tvorcheskih-vesyolyh-aktivnyh-edinomyshlennikov

В Германии призвали Шольца добиться от Путина отмены ограничений для DW

https://ria.ru/20220214/dw-1772720639.html

В Германии призвали Шольца добиться от Путина отмены ограничений для DW

В Германии призвали Шольца добиться от Путина отмены ограничений для DW — РИА Новости, 14.02.2022

В Германии призвали Шольца добиться от Путина отмены ограничений для DW

Немецкий союз журналистов (DJV) призвал канцлера ФРГ Олафа Шольца добиться в Москве на переговорах с российским президентом Владимиром Путиным «немедленной… РИА Новости, 14.02.2022

2022-02-14T14:45

2022-02-14T14:45

2022-02-14T14:45

в мире

олаф шольц

германия

россия

deutsche welle

rt deutsch

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn21. img.ria.ru/images/07e6/02/03/1770914247_0:160:3072:1888_1920x0_80_0_0_4927328698789177f32070518d0cb859.jpg

БЕРЛИН, 14 фев – РИА Новости. Немецкий союз журналистов (DJV) призвал канцлера ФРГ Олафа Шольца добиться в Москве на переговорах с российским президентом Владимиром Путиным «немедленной отмены» ограничений для Deutsche Welle, принятых ранее российской стороной в ответ на запрет вещания в Германии российского телеканала RT DE, а также поддержать немецких корреспондентов в России.МИД РФ ранее заявил, что Россия в ответ на прекращение вещания телеканала RT DE в Германии закрывает корпункт Deutsche Welle в РФ и аннулирует аккредитации всех сотрудников его российского бюро, а также прекращает спутниковое и иное вещание канала в России. Если Германия пойдет на нормализацию ситуации вокруг RT DE, Москва пойдет Берлину навстречу, заявила официальный представитель МИД России Мария Захарова.»Он (Шольц — ред) должен настаивать на немедленной отмене ограничений для Deutsche Welle. В письме председателя DJV Франка Юбералла канцлеру говорится: «Поэтому я прошу вас использовать все ваши полномочия с российской стороной, чтобы обеспечить немедленную отмену приостановки деятельности Deutsche Welle. Кроме того, российские власти должны немедленно пресечь любые попытки помешать немецким корреспондентам в стране заниматься своей профессиональной деятельностью», — говорится в заявлении, опубликованном на сайте DJV.В заявлении указано, что «немецкие СМИ, аккредитованные в России, должны до 8 февраля предоставить властям информацию о своей якобы экономической зависимости от правительства Германии». В организации призвали защитить «интересы журналистов относительно политики Российской Федерации».Комиссия регистрации и надзора медиарегуляторов ФРГ 1 февраля официально запретила вещание телеканала RT DE в Германии, заявив, что у организаторов вещания нет необходимого разрешения. RT DE Productions обжалует в суде решение немецкого регулятора. В МИД РФ пояснили, что телеканал осуществлял деятельность на основе выданной Сербией лицензии и в полном соответствии с Европейской конвенцией о трансграничном телевидении, участницей которой является и ФРГ. МИД заявил, что приступает к реализации ответных мер в отношении аккредитованных в России германских СМИ, а также интернет-посредников, произвольно и безосновательно удаливших аккаунты телеканала со своих платформ. Ранее высокопоставленный источник в российском МИД сообщил РИА Новости, что в ходе январского визита главы МИД Германии Анналены Бербок в Москву были предложены пути выхода из кризиса вокруг RT DE, но Берлин отказался это обсуждать.

https://ria.ru/20220205/zakharova-1771280394.html

https://ria.ru/20220204/germaniya-1770984526.html

германия

россия

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2022

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdnn21. img.ria.ru/images/07e6/02/03/1770914247_171:0:2902:2048_1920x0_80_0_0_88948baeec994b2738be3511a94a21f8.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

в мире, олаф шольц, германия, россия, deutsche welle, rt deutsch

В Германии призвали Шольца добиться от Путина отмены ограничений для DW

БЕРЛИН, 14 фев – РИА Новости. Немецкий союз журналистов (DJV) призвал канцлера ФРГ Олафа Шольца добиться в Москве на переговорах с российским президентом Владимиром Путиным «немедленной отмены» ограничений для Deutsche Welle, принятых ранее российской стороной в ответ на запрет вещания в Германии российского телеканала RT DE, а также поддержать немецких корреспондентов в России.

МИД РФ ранее заявил, что Россия в ответ на прекращение вещания телеканала RT DE в Германии закрывает корпункт Deutsche Welle в РФ и аннулирует аккредитации всех сотрудников его российского бюро, а также прекращает спутниковое и иное вещание канала в России. Если Германия пойдет на нормализацию ситуации вокруг RT DE, Москва пойдет Берлину навстречу, заявила официальный представитель МИД России Мария Захарова.

5 февраля, 22:46

Захарова назвала DW пропагандистской машиной НАТО»Он (Шольц — ред) должен настаивать на немедленной отмене ограничений для Deutsche Welle. В письме председателя DJV Франка Юбералла канцлеру говорится: «Поэтому я прошу вас использовать все ваши полномочия с российской стороной, чтобы обеспечить немедленную отмену приостановки деятельности Deutsche Welle. Кроме того, российские власти должны немедленно пресечь любые попытки помешать немецким корреспондентам в стране заниматься своей профессиональной деятельностью», — говорится в заявлении, опубликованном на сайте DJV.

В заявлении указано, что «немецкие СМИ, аккредитованные в России, должны до 8 февраля предоставить властям информацию о своей якобы экономической зависимости от правительства Германии». В организации призвали защитить «интересы журналистов относительно политики Российской Федерации».

Комиссия регистрации и надзора медиарегуляторов ФРГ 1 февраля официально запретила вещание телеканала RT DE в Германии, заявив, что у организаторов вещания нет необходимого разрешения. RT DE Productions обжалует в суде решение немецкого регулятора. В МИД РФ пояснили, что телеканал осуществлял деятельность на основе выданной Сербией лицензии и в полном соответствии с Европейской конвенцией о трансграничном телевидении, участницей которой является и ФРГ. МИД заявил, что приступает к реализации ответных мер в отношении аккредитованных в России германских СМИ, а также интернет-посредников, произвольно и безосновательно удаливших аккаунты телеканала со своих платформ.

Ранее высокопоставленный источник в российском МИД сообщил РИА Новости, что в ходе январского визита главы МИД Германии Анналены Бербок в Москву были предложены пути выхода из кризиса вокруг RT DE, но Берлин отказался это обсуждать.

4 февраля, 08:00

Удивить и возмутить Германию: Россия остановила «Немецкую волну»

10 лет отметил зеленодольский театр-студия «Хамелеон»

Первый большой юбилей — десятилетие — отметил зеленодольский театр «Хамелеон», который обрёл место прописки в лицее №9 им. Пушкина

Благодаря участию в замечательных спектаклях обычные школьники смогли окунуться в мир Театра, открыть в себе артистические способности.

Бессменным руководителем «Хамелеона» является Игорь Игнатьев. Он ещё молод, но за десять лет прошагал большой путь вместе с несколькими поколениями лицеистов. Юбилейный вечер — прекрасное тому подтверждение: он превратился не просто в празднование Даты, а в признание в любви. Ребята, которые уже перешагнули порог школы, вернулись на сцену, чтобы вспомнить лучшие фрагменты спектаклей, в которых они когда-то играли. И этот калейдоскоп образов, интересных режиссерских решений заворожил, дал понять, насколько глубокий, ищущий режиссер здесь работает.

После спектакля мы задали Игорю Игнатьеву несколько вопросов.

— Во время сегодняшнего спектакля думала: как же повезло лицею, детям, родителям, что здесь работает самый настоящий театр. Ребята не только открывают себя, свои возможности, но и раздвигают рамки школьной программы, больше читают. А как вы выбираете из школьников тех, кто сможет блистать на сцене?

—У нас простой набор, объявляем кастинг и приглашаем всех желающих. Подчеркну — желающих. Это одно из важнейших условий. Главное ведь — гореть этим делом. Мы всегда рады разным людям. Ведь каждый человек уникален. Но важна и цель, с которой к нам приходит мальчик или девочка. Порой сразу видно, что способный, но не хочет трудиться, а театр — это огромный труд, работа над образом. И возникает ощущение, что пришел, лишь бы закрыть гештальт — мол, я побывал в «Хамелеоне». Нет. У нас камерный театр. Это особенность. Другая подача, другая энергия в спектаклях. Сцена маленькая и близко к зрителю, ты как на ладони… И значит, отдача возрастает в разы… Да, мы принимаем абсолютно каждого, но важно любить театр в себе, а не себя в театре. 

— Кто-то после окончания лицея выбрал своей профессией служение искусству?

— Любовь Ульянова успешно поступила в Воронежский институт культуры на театральный факультет. Она в свое время создала авторский спектакль на нашей сцене «Он и она» — чудесный душевный спектакль по письмам ее родителей в молодости.
Гордость театра — Эмиль Сагдиев. Он сейчас актер Русского драматического театра в Стерлитамаке. Невероятный парень. Открытый. Честный. После лицея успешно окончил Казанское театральное училище, в конце 4 курса его пригласили в Стерлитамакский театр сыграть роль. Понравился. И теперь он актер большого профессионального театра. Чему мы бесконечно рады!

— А кто повлиял на вас, Игорь Сергеевич?

— Я всегда с трепетом и уважением говорю о моих театральных учителях. Это Светлана Геннадьевна Буза, руководитель театральной студии «Алпар». Это мои студенческие мастера — Геннадий Николаевич Прытков и Ирина Игоревна Чернавина. Звёзды театра имени Качалова. Потрясающе талантливые актёры, у которых сотни поклонников. И просто удивительные люди! Эти три человека дали мне три главных качества в творческой профессии — свободу, уверенность и опыт.
Уже работая в «Хамелеоне», я влюбился в Малый Драматический театр — Театр Европы в Санкт-Петербурге. Главный режиссёр театра Лев Абрамович Додин для меня великий человек. Театральная глыба. Живая легенда. 
Нравится творчество главного режиссёра театра Маяковского Эймунтаса Някрошюса. Люблю спектакли Петра Наумовича Фоменко, Вячеслава Бутусова. Симпатично видение Виктора Рыжакова. Их спектакли подпитывает меня и вдохновляют.
Но есть ещё люди не из театрального мира, но чья поддержка чрезвычайно важна. Всегда буду помнить Валентину Васильевну Кибец, она поверила в нас, выделила место в лицее, понимая, какую роль играет театр в воспитании детей. Всегда была зрителем — искренним, сопереживающим — на наших спектаклях. Сегодня на юбилее нас тепло поздравляла новый директор лицея Алия Юнусовна Шагаева, она — за все наши идеи, за творчество, поиск новых форм. 

— Как вы выбираете материал для постановки?

— Он должен меня задеть. В самое сердце! И это бывает редко. Но если случается — то ты уже живешь им и днём, и ночью. Затем, конечно, идет трансформация материала, ведь нельзя просто взять текст и перенести на сцену. Нужно изучить автора, понять, что он хотел сказать. Внести свою лепту. Найти актуальность. Расставить акценты. Долгая работа… Но очень интересная. Очень… По сути первое знакомство с материалом — интимный момент. Должна быть полная тишина. Внутреннее спокойствие. Никаких лишних мыслей. Ты и текст. Медленно, вдумчиво, глубоко подходить к каждому слову, к мыслям автора…

— Сейчас жизнь так быстротечна, так кардинально меняется мир. Это не может не отражаться и на вашей работе, на приоритетах.

—Да, совершенно верно… Театр за десятилетие менялся вместе со мной и теми, кто приходил в него. В пандемию мы какое-то время пребывали в неизвестности. А потом создали проект «Пауза»: монологи зрителей на важные для них темы. Показали его под открытым небом — необычайно интересный опыт.

В Новый год создали зимнюю сказку по рассказам шведской писательницы Туви Янссон для самых юных зрителей. Нас так тронуло, что во время постановки в зале была полная тишина, несмотря на юный возраст, ребята очень внимательно смотрели, вникали, переживали. К нам даже приезжали зрители из Казани, чтобы посмотреть «Зимнюю сказку».

— Что впереди?

— Сейчас мы немного отдохнем, и снова в поиск. Нам уже 10 лет, это обязывает… Есть стремление к новому уровню, новому этапу. Мы вместе с труппой уже строим планы, пока секрет, что это будет. Удивительно, мне на день рождения театра друзья подарили печенье с предсказанием, и там была написана фраза: «Никогда не стоит хвастаться будущим». Есть внутренний камертон, который не обманывает нас уже 10 лет. Думаю, он поможет нам и в будущем.

— Спасибо вам, Игорь Сергеевич, за вашу преданность искусству, за открытие талантов, за воспитание чувств!

Теперь новости Зеленодольска вы можете узнать в нашем Telegram-канале

Следите за самым важным и интересным в Telegram-канале Татмедиа

Стал известен полный список конкурсных работ мультфестиваля в Суздале

Мультфест традиционно пройдёт в киноконцертном зале суздальского

Главного туристического комплекса. В конкурсной программе примет

участие 101 работа в шести категориях – от студенческих до

профессиональных, от короткометражек до полного метра.

Традиционно приедет Президент фестиваля Александр Герасимов и мы

очень надеемся снова увидеть на фестиваля «отца» культового мультфильма

про Ёжика, шедшего сквозь туман к Медвежонку – Юрия Норштейна.

Отбирала работы профессиональная селекционная комиссия. Она и

определила лучшие работы, которые будут показаны на

большом экране в Суздале – и перед гостями, и перед участниками, и перед

жюри феста.

Авторам мультфильмов конкурсной программы (только одному

представителю от фильма и желательно режиссёру) Дирекцией фестиваля

будет оплачен проезд по маршруту Москва-Суздаль-Москва. Плюс будут

предоставлены аккредитация, проживание и двухразовое питание.

Вот полный и утверждённый список конкурсных работ ОРФАК-27:

1 «10 тысяч километров», 6 мин. 35 сек., реж. Рябова Варвара, Сильвестрова

2 «Апноэ», 4 мин. , реж. Кононова Александра, Школа-студия «ШАР»

3 «Бежа, бежа по выставке», 4 мин. 20 сек., реж. Торопова Анастасия, Школа-

4 «До темноты», 2 мин. 37 сек., реж. Погудин Паша, Куликов Макс, УрГАХУ,

5 «Дорога тысячи ворот», 6 мин. 12 сек., реж. Объедкова Варвара, ВГИК

6 «Задверье», 6 мин. 28 сек., реж. Каморина Анастасия, Максимова Мария,

7 «Звёздный улов», 4 мин. 04 сек., реж. Генералова Пелагея, УрГАХУ, Фонд

8 «Зоотроп», 1 мин. 28 сек., реж. Шитикова Татьяна, Смоленцева Валерия,

УрГАХУ

9 «Искра», 2 мин.08 сек., реж. Набиулина Валентина, УрГАХУ

10 «Искры в темноте», 3 мин., реж. Девятова Евгения, СПбГИКиТ

11 «Кабаре», 4 мин. 02 сек., реж. Григорова Марианна, ВГИК

12 «Калокери», 1 мин. 59 сек., реж. Жаркова Ирина

13 «Мама и животные», 2 мин. 50 сек., реж. Задарко Юлия, Ростовский-На-

Дону филиал ВГИК

14 «Мармелад», 4 мин. 36 сек., реж. Любимцева Анна, НИУ ВШЭ

15 «Маруська», 4 мин. 48 сек., реж. Смоляр Людмила, ВГИК

16 «Маска», 3 мин. 54 сек., реж. Манцерева Дарья, ВГИК

17 «Морожены Волки», 3 мин. 57 сек., реж. Лавриков Данил, ВГИК

18 «Муравьиный марш», 5 мин. 22 сек., реж. Юдин Федор, Школа-студия

«ШАР»

19 «На бегу», 3 мин. 27 сек., реж. Климова Анастасия, СПбГИКиТ

20 «На море», 7 мин. 20 сек., реж. Догаева Анна, ВГИК

21 «Несчастный», 1 мин.19 сек., реж. Шитикова Татьяна, УрГАХУ

22 «Носок», 6 мин. 51 сек., реж. Чикерлан Анастасия, ВГИК

23 «Подружки», 4 мин.09 сек., реж. Абрамова Наталья, ВГИК

24 «Почему у белого медведя нос чёрный?», 3 мин. 17 сек., реж.

Митрофанова Екатерина, ВГИК

25 «С птичьего крыла», 1 мин. 25 сек., реж. Шустова Полина

26 «Сближение», 5 мин.43 сек., реж. Тютерев Валентин, ВГИК

27 «Свёрток», 5 мин.08 сек., реж. Щербатова Зинаида, ВГИК

28 «Слепые», 5 мин. 16 сек., реж. Верейкина Анастасия, ВГИК,

29 «Солнечный удар», 4 мин. 04 сек., реж. Артамонова Анна, ВГИК

30 «Тать», 3 мин. 44 сек., реж. Ульянова Екатерина, ВГИК

31 «У неба нет края», 3 мин. 44 сек., группа авторов, Цех Анимации

32 «Холодает», 3 мин. 35 сек., реж. Рузанова Дарья, СПбГИКиТ

33 «Частушки», 2 мин. 50 сек., реж. Мещеряков Никита, Школа-студия ШАР

 

Дебютные фильмы

1 «Большой Tыль», 6 мин. 06 сек., реж. Осипова Алиса, Creative Space studio,

Таллин (Эстония)

2 «В море», 7 мин. 30 сек., реж. Соколов Андрей, Студия «Пчела»

3 «Встреча», 5 мин. 52 сек., реж. Криволуцкая Александра, Школа-студия

ШАР

4 «Куда уходят папы», 5 мин., реж. Хабарова Алина, Кинокомпания СНЕГА

5 «Мой комбез», 4 мин. 38 сек., реж. Железнова Мария, Студия «Урал

Синема»

6 «Не для меня», 8 мин. 06 сек., реж. Бондаренко Иван, Школа-студия ШАР

7 «Правильная остановка», 6 мин. 30 сек., реж. Ракитина Мария. Школа-

студия ШАР

8 «Рождение формы», 6 мин. 39 сек., реж. Огородникова Екатерина

9 «Русалка», 8 мин. , реж. Жукова Светлана. Студия «А-фильм»

10 «Фантасмагория в стиле модерн (концерт на крыше)», 6 мин. 52 сек., реж.

Броневицкая Оксана, Кинокомпания «Мастер — фильм»

11 «Чадо», 7 мин.26 сек., реж. Гаррисон Доминика

 

Авторские короткометражные фильмы

1 «Андердог», 5 мин. 41 сек., Галактионов Василий

2 «Белый-белый день», 5 мин. 53 сек., реж. Чирков Василий, Киностудия

«Союзмультфильм»

3 «Бестиарий», 10 мин. 54 сек., реж. Бахурин Андрей, Кинокомпания

«Мастер-Фильм»

4 «Горю!», 7 мин. 15 сек., реж. Дьяков Антон

5 «Две сестры», 14 мин. 04 сек., реж. Буданова Анна, IMAKA FILMS

6 «Дровосекова краюшка», 13 мин. 10 сек., реж. Почивалов Алексей,

Анимационная Студия «Пилот»

7 «Завтрак для улиток», 7 мин. 07 сек., реж. Фадеев Евгений, Школа-студия

ШАР

8 «Ивановы вары», 6 мин. 01 сек., реж. Стрелков Евгений, Студия

«Дирижабль»

9 «Квартира тиха, как бумага», 2 мин. 12 сек., реж. Алдашина-Филиппова

Екатерина, Студия БФМ

10 «Костёр в заповеднике», 6 мин. 14 сек., реж. Милославская Екатерина,

ООО «Юпитер ХХI»

11 «Крылья для друга», 3 мин., реж. Алдашин Михаил, Арефьев Константин,

Киностудия «Союзмультфильм»

12 «Маленькая девочка стаскивает скатерть», 1 мин. 50 сек., реж. Скворцова

Елизавета, Институт Адама Мицкевича, Culture.pl

13 «Мамина пуговка», 6 мин., реж. Крицкая Анна, Студия «А-фильм»

14 «Мой друг Тигр», 7 мин., реж. Киселёва Татьяна, Киностудия

«Союзмультфильм»

15 «Огурцы»,15 мин. 43 сек., реж. Шмельков Леонид, Школа-студия ШАР

16 «Ой чие ж то жито», 6 мин. 51 сек., реж. Швейгольц Анна, Школа-студия

ШАР

17 «Песочница», 11 мин., реж. Бардин Гарри. ООО Фирма «Стайер»

18 «Поговорим?», 5 мин., реж. Михеева Катя

19 «Прелюдия и фуга», 13 мин., реж. Волчек Игорь, Республиканское

унитарное предприятие Национальная киностудия «Беларусьфильм»

20 «Синий лев», 17 мин. , реж. Трофимова Зоя, «Студия Пчела», IMAKA

FILMS

21 «Снег идёт», 2 мин., реж. Бисярина Нина, АО Киностудия

«Союзмультфильм»

22 «Трамвай № 8», 13 мин., реж. Подивилов Станислав, Кинокомпания

«Мастер-Фильм»

23 «Тучкины Штучки», 2 мин., реж. Скворцова Елизавета, Киностудия

«Союзмультфильм»

24 «У горы, на горе», с горы, 11 мин. 11 сек., реж. Кадыкова Анна. Школа-

студия ШАР

25 «Убить дракона», 5 мин 55 сек., реж. Шарафутдинов Рим. ООО «Юпитер

XXI»

26 «Чужой хлеб», 7 мин. 11 сек., реж. Бахурин Андрей, «Гамма Фильм»

 

Прикладная анимация

1 «В воздушном дрифте», 1 мин., реж. Милославская Екатерина

2 «Волшебник-недоучка», 3 мин. 39 сек., реж. Меринов Сергей, АО

«Аэроплан»

3 «Всемирный день борьбы против малярии», 48 сек., реж. Мигунова Дана

4 «Добрый жук», 2 мин. 56 сек., реж. Холодова Оксана. АО «Аэроплан»

5 «Жук и желудь», 3 мин. 25 сек. , реж, Мижуй Денис

6 «Заставка XV Большого фестиваля мультфильмов», 40 сек., реж. Яковлева

Варя, Студия БФМ

7 «История мирного атома и термоядерный синтез», 5 мин. 37 сек., реж.

Эльшанская Ирина, Студия БФМ

8 «История отечественной школы медицины», 6 мин. 03 сек., реж.

Бондаренко Иван, Студия БФМ

9 «Карл Вебер», 1 мин. 46 сек., реж. Погудин Павел

10 «Комсомольск – Скука», 2 мин. 31 сек., реж. Рахматуллоева Нигина, НИУ

ВШЭ

11 «Край чудес», 3 мин. 45 сек., реж. Бездудный Константин. Анимационная

студия «Мечталет»

12 «Левайс», 2 мин. 18 сек., реж. Куликов Макс, «Светлые Истории»

13 «Легенды Орлёнка. Легенда об Истине», 1 мин. 22 сек., реж. Томилов

Юрий, «Светлые Истории»

14 «Матч – Евро 2020», 58 сек., реж. Черникевич Игорь, Hunters Animation

Studio

15 «Московский пассажир Льюис Кэрролл», 6 мин. 44 сек., реж. Стрелков

Евгений, «Студия Дирижабль»

16 «Нехватка витамина Д», 1 мин. 30 сек., реж. Подъячева Светлана,

17 «Новая история Земли», 6 мин. 12 сек., реж. Пивоварова Александра,

Студия «Да»

18 «Пётр Налич – Why Shoe Man», 4 мин. 03 сек., реж. Ким Ситора, Токарева

Ксения, Жордания Мариам, НИУ ВШЭ

19 «Подсолнух. История Алисы», 2 мин. 36 сек., реж. Эльшанская Ирина,

Студия БФМ

20 «Преступление и наказание: киберпанк-версия», 3 мин. 23 сек., реж.

Воронин Денис, Анимационная Студия «Делай»

21 «Сердце», 5 мин. 01 сек., реж. Богуславский Юрий, Цех Анимации

22 «FEELS», 3 мин. 50 сек., реж. Блюменкранц Кирилл, HonkFu

23 «Fire Granny — Девки пляшут», 3 мин. 46 сек., реж. Потемкина Наталья

 

Сериалы

1 «Бабочки прилетают!» (сериал «Сказки из лукошка»), реж. Троицкая

Анастасия, «ДСП»

2 «Волшебная книга» (сериал «Азбука опасностей»), 13 мин., реж. Кублицкая

Татьяна, «Беларусьфильм»

3 «Дело вещей птицы Гамаюн» (сериал «Приключения Пети и Волка»), 11

мин. , реж. Мирзоян Наталья, Киностудия «Союзмультфильм»

4 «День Волшебния» (сериал «Чуч-Мяуч»), 7 мин., реж. Шахова Галина,

Киностудия «Союзмультфильм»

5 «Десять монеток» (сериал «Тайная комната»), 7 мин. 16 сек. реж. Басова

Ольга, Банана Анимейшн

6 «Диди» (сериал «Диди»), 16 мин. 30 сек., реж. Тарасова Ирина,

«Беларусьфильм»

7 «Концерт» (сериал «Ладушки 2.0»), 4 мин. 06 сек., реж. Васильев

Александр, Студия «Мастер-Фильм»

8 «Королев» (сериал «МультиКосмос»), 3 мин. 11 сек., реж. Федоров

Владимир, Студия анимации «Мультограм»

9 «Отцы и дети» (сериал «Капризка»), 8 мин. 04 сек., реж. Наиль Мубинов,

Продюсерский центр Капризка

10 «После нас» (мини-сериал «Мал, да удал!»), 6 мин. 30 сек., реж.

Струсовский Сергей, Киностудия «Союзмультфильм»

11 «Привет, сосед!» (сериал «Привет, сосед!»), 14 мин. 30 сек., реж. Демидов

Дмитрий, Студия Продюсерского Кино

12 «Русалка» (сериал «Пушкин и. ..»), 6 мин. 01 сек., реж. Мальгин Александр

13 «Гора вещей» (сериал «Соня и Леня»), 5 мин. 43 сек., реж. Воронин Денис,

Анимационная Студия «Делай»

 

Полнометражные фильмы

1 «Ганзель, Гретель и Агентство Магии», 1 час 44 мин., Цицилин Алексей,

Wizart Animation

2 «Звезды седьмого неба», 1 час 12 мин., Турова Елена, Национальная

киностудия «Беларусьфильм»

3 «Кощей. Начало», 1час 30 мин., Колпин Андрей, Анимационная студия

«Паровоз»

4 «Плюшевый Бум!», 1 час 11 мин., Чернов Денис, Куприянов Илья, Студия

компьютерной анимации «Петербург»

5 «Три богатыря и Конь на троне», 1 час 15 мин., Шмидт Дарина, Студия

«Мельница».

 

Уважаемые читатели, присоединяйтесь к нам в соцсети ВКонтакте. Если вам есть чем поделиться с редакцией «Царьград Владимир/Иваново», присылайте свои наблюдения, вопросы, новости на электронную почту vladimir@tsargrad. tv.

 

46 синонимов STUDIO — Merriam-Webster

Тезаурус

1 здание, в котором делаются вещи
  • У него была небольшая художественная студия в центре города.
  • Она направилась в студию , чтобы записать свой первый альбом.

Синонимы и близкие синонимы для studio

2 небольшое частное жилище, которое является одним из группы жилищ в одном здании или блоке
  • Они искали квартиру побольше, но вместо этого решили арендовать студию из-за ее центрального расположения.

Синонимы и близкие синонимы для studio

  • няня
  • (также спальня или кровать-гостиная)
  • [Британский],
  • совместное проживание,
  • квартира,
  • кондоминиум,
  • дуплекс,
  • двухуровневая квартира,
  • эффективность,
  • эффективная квартира,
  • плоская
  • [Британский],
  • сквозной,
  • квартира с садом,
  • квартира бабушки
  • [в основном британцы],
  • мезонет,
  • пентхаус,
  • железнодорожная квартира,
  • салон,
  • салон
  • [в основном британцы],
  • триплекс,
  • прогулка
См. определение в словаре

Программное обеспечение | B&R Industrial Automation

Единственное перспективное решение — это открытое решение. Открытость позволяет вам работать с инструментами, которые вам наиболее удобны. Это позволяет машинам легко взаимодействовать с внешними системами. А за счет упрощения повторного использования существующего программного обеспечения для будущих решений высвобождается драгоценное время для более быстрого вывода вашего продукта на рынок. Проприетарные решения, отойдите в сторону. Будущее за Automation Studio 4.

B&R Automation Studio 4 позволяет программировать ПЛК на всех языках IEC 61131-3, CFC и C, а также объектно-ориентированное программирование на C++.Это не только позволяет программистам работать на предпочитаемом ими языке, но и позволяет легко интегрировать существующий код. Доступность функциональных блоков PLCopen, таких как блоки управления перемещением и безопасностью, еще больше упрощает программирование, равно как и разъемы для интеграции кода, сгенерированного автоматически средствами моделирования.

Файлы проекта передаются исключительно в формате XML, стандарте ИТ де-факто, который обеспечивает открытую связь со сторонними системами, такими как программное обеспечение для управления материальными потоками и планирования производства. Дальнейшая поддержка обеспечивается прямым доступом к базам данных через интерфейс SQL.

Множество интерфейсов к другим системам

B&R Automation Studio 4 использует унифицированную архитектуру OPC (OPC UA) для прямого подключения к уровню управления предприятием. Этот протокол предоставляет удобные функции, которые облегчают жизнь разработчикам, а в качестве недавнего рыночного стандарта с открытой архитектурой он обещает долговременную совместимость с чрезвычайно широким спектром сторонних систем.Automation Studio 4 также поддерживает различные интернет-технологии за счет использования специальных библиотек, которые упрощают внедрение независимых от местоположения подходов к эксплуатации и производству.

Благодаря возможностям прямой интеграции всех систем полевых шин B&R Automation Studio 4 открывает доступ ко всему спектру доступных полевых устройств и обеспечивает оптимальную поддержку системной интеграции сторонних производителей. Интегрированные решения безопасности на основе openSAFETY, также запрограммированные в Automation Studio 4, полностью независимы от используемой системы полевой шины.

Тренажерный зал, меняющий жизнь, и функциональные командные тренировки

Тренажерный зал, меняющий жизнь, и функциональные командные тренировки | F45 Обучение

КОМАНДНЫЕ ТРЕНИРОВКИ


ИЗМЕНЕНИЕ ЖИЗНИ

Добро пожаловать в наше сообщество функционального фитнеса.

F45 Training — это глобальное фитнес-сообщество, специализирующееся на инновационных, высокоинтенсивных групповых тренировках, которые проходят быстро, весело и нацелены на результат. Станьте частью семьи F45 сегодня и убедитесь в том, что отличает нас от других. Поскольку наши фитнес-студии расширяются по всей территории Соединенных Штатов, возможно, рядом с вами есть F45 Training.

НАШ ФИТНЕС-ТРЕНИРОВОЧНЫЙ КЛАСС

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВИИТ
Тренажер

F45 специально разработан для функциональной тренировки всего тела с одновременным повышением уровня энергии, скорости метаболизма, силы и выносливости.

КОМАНДНАЯ ТРЕНИРОВКА

Командный менталитет в F45 Training помогает участникам изменить свой образ жизни физически и умственно, поощряя рост сообщества и отсутствие эгоизма.

45 МИНУТ

F45 Обучение — один из самых эффективных способов обучения.Мы стремимся сжечь до 750 калорий за 45-минутный сеанс.

ЧТО ТАКОЕ F45?

ОБОЗНАЧЕНИЕ «F» ДЛЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ТРЕНИРОВОК, СМЕШАННЫХ КРУГОВЫХ И ВИИТ-ТРЕНИРОВОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ПОВСЕДНЕВНОГО ДВИЖЕНИЯ. 45 – ЭТО ОБЩЕЕ ВРЕМЯ ДЛЯ ПОТНОГО И ЗАБОТАЮЩЕГО СЕРДЦЕ УДОВОЛЬСТВИЯ.

Тренировки каждый раз будут надирать вам задницу, плюс они могут быть изменены для новичков и тех, у кого больше опыта. Это для всех, и я люблю это!

Эми
Член F45

F45 — самая динамичная, эффективная и приятная работа, которую я когда-либо делал! Чувство общности здесь особенное.Мне это очень нравится.

Джон
Член F45

БУКВАЛЬНО АБСОЛЮТНО ЛУЧШИЙ! Тренировки очень сложные, и я всегда ухожу с ощущением, что проделал серьезную работу. Тренеры ОТЛИЧНЫЕ!

Лорен
Член F45

Я пробовал все виды тренировок от CrossFit до Orange Theory Fitness (мне надоело бегать на беговых дорожках). Воспользуйтесь их БЕСПЛАТНОЙ пробной версией, после нескольких сеансов вы будете на крючке!

Эван
Член F45

ИННОВАЦИИ.

Мы непохожи на другие фитнес-залы рядом с вами. Наши занятия по функциональному фитнесу постоянно совершенствуются, поэтому практически не бывает двух одинаковых тренировок!

ВЫУЧИТЬ БОЛЬШЕ

МОТИВАЦИЯ.

Мотивация и поощрение в групповом тренировочном центре создают пульсирующую, оптимистичную среду, в которой цели достигаются и перевыполняются.

ВЫУЧИТЬ БОЛЬШЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Когда дело доходит до контроля веса, жизненно важно правильное питание. F45 Training предоставляет всем участникам доступ к их собственной бесплатной личной программе питания для достижения целей в области здоровья с ежедневными планами питания, отслеживанием и поддержкой сообщества.Добро пожаловать на вызов F45.

ВЫУЧИТЬ БОЛЬШЕ

КОМАНДНАЯ ТРЕНИРОВКА. ЖИЗНЬ ИЗМЕНЯЕТСЯ.



Этот веб-сайт использует файлы cookie для улучшения взаимодействия с пользователем. Мы используем файлы cookie в соответствии с нашей Политикой конфиденциальности.




Политика конфиденциальности и использования файлов cookie

Ошибка MSBuild MSB8036 — MSBuild

  • Статья
  • 2 минуты на чтение
Полезна ли эта страница?

Полезна ли эта страница?

да Нет

Любая дополнительная обратная связь?

Отзыв будет отправлен в Microsoft: при нажатии кнопки отправки ваш отзыв будет использован для улучшения продуктов и услуг Microsoft.Политика конфиденциальности.

Представлять на рассмотрение

В этой статье

Windows SDK « версия » не найден

Эта ошибка возникает, когда Visual Studio или MSBuild не могут найти Windows SDK, запрошенный вашим проектом, в ожидаемом месте.

Версия Windows SDK, указанная в проекте

Если вы создаете проект в Visual Studio, первое, что нужно проверить, — это то, что проект предназначен для правильной версии Windows SDK.Щелкните правой кнопкой мыши узел проекта и выберите Properties или нажмите Alt + Enter . Появится диалоговое окно Страницы свойств для вашего проекта. В разделе Свойства конфигурации > Общие найдите Windows SDK версии . Например, это может быть 10 (последняя установленная версия) , что выбирает самую последнюю версию, если установлено более одной версии. Если вы выберете раскрывающийся список, вы увидите конкретные версии, обнаруженные Visual Studio. Убедитесь, что выбрана нужная вашему проекту версия.

Если вы используете MSBuild напрямую, а не с Visual Studio, вам следует проверить места, где может быть установлено свойство WindowsTargetPlatformVersion . Обычно он находится в файле проекта, но также может быть в импортированном файле или в файле глобальных настроек, таком как Directory.build.props . Этот файл может находиться в любом месте родительского пути к вашему проекту, вплоть до корня диска. Параметр по умолчанию во вновь созданном файле проекта выглядит следующим образом:

.
  10.0
  

Также проверьте сценарии сборки или задания CI, которые вызывают MSBuild. Убедитесь, что командная строка не передает недопустимое значение для этого свойства.

Установите или переустановите Windows SDK

Если это не решит проблему, установите или переустановите версию Windows SDK, необходимую вашему проекту. Вы можете установить определенные версии Windows SDK с помощью установщика Visual Studio. Выберите версию в Отдельные компоненты .Вы также можете загрузить Windows SDK из Центра разработки для Windows.

См. также

Golden-Road.net — Индекс

Фронт-офис

Проверяйте здесь периодические объявления от администраторов форума и обсуждения сайта в целом.

513 сообщений
37 тем

Последнее сообщение от Thrasher
в Re: Timeline Issues
25 ноября 2021 г., 17:20:12

РАЗГОВОР правильный

Обсуждения, связанные с The Price is Right, можно найти здесь! Новости, информация, обзоры, международные версии, заявки на билеты, запись митапов! Цена ЗДЕСЬ!

161582 Сообщений
8586 Тем

Последнее сообщение от blozier2006
в Re: Phone Home Game ques…
12 февраля 2022 г. , 21:32:03

Цена правильная Резюме!

Резюме, резюме и обсуждение каждого первого эпизода знаменательного 50-го сезона Price!

1135 сообщений
110 тем

Последнее сообщение от SeaBreeze341
в Re: Резюме TPiR — 14.02.20…
на Сегодня в 12:52:04

Цена БЫЛА ПРАВИЛЬНОЙ

Резюме и обсуждения прошлых эпизодов TPiR из предыдущих сезонов!

1871 сообщений
753 темы

Последнее сообщение от harvsoul
в отчете за 03 ноября 1…
08 февраля 2022 г., 05:57:43

Детские доски : Эра Кэри, Эра Баркера, Ночные версии, Эра Каллена, Международная версия
Цена правильная Коллекция видео

У вас есть видео, которым вы хотите поделиться с нами? Используйте этот форум, чтобы вставлять видео с Youtube и т. д. для всеобщего обозрения!

9345 сообщений
3215 тем

Последнее сообщение от OneBidTris
в Re: 3 мая 1988 г. (#6872D)
от 09 февраля 2022 г., 16:36:38

CSS — Демонстрация чата Showoff

Здесь вы можете узнать, кто сделал лучшую ставку в нашей игре CSS.Присоединяйтесь к этой игре в прямом эфире каждый будний день в дневном чате Golden-Road.net, организованном Wayoshi.

19951 сообщений
3399 тем

Последнее сообщение от Wayoshi
в Результаты CSS за 14.02.20…
на Сегодня в 17:49:25

FPG — пятничная игра-предсказание

Присоединяйтесь к нам, поскольку мы пытаемся использовать линейку игр этой недели, чтобы определить пятничную линейку, организованную OneBidTris.

4612 Сообщений
1442 Тем

Последнее сообщение от OneBidTris
в FPG 11. 02.22 — РЕЗУЛЬТАТЫ
на Вчера в 16:45:04

Разместите свой собственный!

Думаете, у вас есть все необходимое, чтобы стать следующим ведущим шоу «Цена верна»? Попробуйте свои силы, организовав собственную фиктивную игру TPIR, и играйте так же, как в шоу! Кроме того, наслаждайтесь играми прошлого с разрозненными моделями и комментаторами CU, сумасшедшими настройками Мэллори и ilovesuperball…ну все.

48442 Сообщений
438 Тем

Последнее сообщение от Alfonzo
в Re: The Price is Right a…
04 февраля 2022 г., 17:00:04

Билеты и тур по студии — NBC.com

Для получения подробной информации ознакомьтесь с отдельными шоу ниже:

Билеты на шоу NBC, записанные в Нью-Йорке, больше не доставляются по почте.Вся информация о билетах NBC (для Нью-Йорка) подробно описана в нашей линии билетов (212) 664-3056.


America’s Got Talent возвращается, и билеты в зрительный зал БЕСПЛАТНЫ! Присоединяйтесь к ведущему Терри Крюсу и судьям Хоуи Манделу, Габриэль Юнион, Джулианне Хаф и Саймону Коуэллу, когда соревнуются лучшие исполнители-любители страны. Приобретайте билеты на концерты в Лос-Анджелесе прямо сейчас. НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ БИЛЕТЫ НА AMERICA’S GOT TALENT!

К началу страницы


Не упустите шанс увидеть захватывающую игру American Ninja Warrior LIVE! НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПРИОБРЕСТИ БИЛЕТЫ НА AMERICAN NINJA WARRIOR!

К началу страницы


Вы можете зарезервировать бесплатные билеты на запись «Поздней ночи с Сетом Мейерсом», перейдя по адресу: 1iota.ком.

Мы публикуем даты шоу и заявки на билеты по мере их поступления. Пожалуйста, проверьте 1iota, чтобы быть в курсе о шоу и наличии билетов. Запросы не могут быть отправлены на даты, которые не опубликованы в календаре.

Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .

На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун.Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.

Вам нужно будет зарегистрироваться на 1iota, чтобы подать заявку на билеты на «Позднюю ночь с Сетом Мейерсом». Мы рекомендуем вам сделать это до выпуска билетов, нажав здесь: Регистрация участника 1iota. Когда вы подаете заявку на билеты на «Позднюю ночь с Сетом Мейерсом», вы автоматически попадаете в список ожидания. На данный момент у вас нет билета. Если мы сможем выполнить ваш запрос на билет, с вами свяжутся через 1iota.Если вы не получили уведомление от 1iota, мы, к сожалению, не смогли выполнить ваш запрос на билеты, и у вас нет билетов.

Все билеты бесплатны и не могут быть проданы или проданы с аукциона. Late Night with Seth Meyers и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право ОТЗЫВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.

Резервные карты

Резервные карты теперь доступны каждое утро с 9:00 до 11:00 по восточному стандартному времени на стойке приветствия, расположенной в центре вестибюля 30 Rockefeller Plaza (через 49-ю и 50-ю улицу.входы) прямо перед Большой лестницей. После 11:00 по восточному поясному времени резервные карты будут доступны в магазине NBC Studios, также расположенном по адресу: 30 Rockefeller Plaza (через вход с 6-й авеню между 49-й и 50-й улицами) до 13:30. После получения пронумерованной резервной карты вам будет предложено вернуться в определенное время во второй половине дня, чтобы зарегистрироваться и посмотреть, сможем ли мы принять вас для записи во второй половине дня. Резервные карты раздаются утром перед записью каждого шоу.

Для получения дополнительной информации о The Shop и его часах работы посетите веб-сайт The Shop at NBC Studios.

Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen).Доказательством вакцинации должен быть действительный и утвержденный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства наличия вакцины, не допускаются.

Количество мест ограничено! Любой, кто получает карту, должен быть старше 16 лет (независимо от того, присутствует ли родитель или опекун). Резервные карты ограничены одной (1) на человека и выдаются в порядке очереди. Резервные карты не гарантируют вход.

К началу страницы


Смотрите Little Big Shots LIVE бесплатно. НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПРИОБРЕСТИ БИЛЕТЫ НА LITTLE BIG SHOTS.

К началу страницы


Тур по NBC Studios приостановлен до дальнейшего уведомления. Пожалуйста, следите за обновлениями.

Посмотрите студии, в которых снимаются ваши любимые шоу, такие как «Субботним вечером в прямом эфире», «Вечернее шоу с участием Джимми Фэллона», «Поздняя ночь» с Сетом Мейерсом, «Ночные новости NBC» с Лестером Холтом и другие.

Помимо эксклюзивного доступа в студию, страница NBC проведет вас по историческим залам 30 Rockefeller Plaza, где вы сможете заглянуть за кулисы процесса производства телепрограмм. Вы узнаете о написании сценариев, продюсировании и о том, как телевизионный контент попадает к вам домой.

Затем испытайте все это на собственном опыте, посетив нашу Tour Studio и создав собственное шоу, которое вы можете бесплатно скачать и поделиться с друзьями и семьей.

Экскурсия по NBC Studios начинается и заканчивается в магазине NBC Studios, где вы можете найти эксклюзивную одежду, предметы коллекционирования и многое другое из ваших любимых шоу NBC.Магазин расположен на уровне вестибюля 30 Rock на Avenue of the Americas/6th Ave между 49-й и 50-й улицами.

Получите информацию о билетах и ​​ценах на сайте www.TheTouratNBCStudios.com или по телефону 212-664-3700. Тур в NBC Studios проводится ежедневно с 8:20 до 14:00 с понедельника по пятницу и с 8:20 до 17:00 в субботу и воскресенье. Тур в NBC Studios соответствует требованиям ADA и доступен для гостей с разными способностями.

К началу страницы


Розыгрыш билетов в субботу вечером в прямом эфире на сезон 2021-2022 закрыт. Розыгрыш билетов на сезон 2022-2023 гг. начнется в 00:00 по восточному стандартному времени 1 августа 2022 г. и продлится до 23:59 по восточному поясному времени 31 августа 2022 г. Чтобы принять участие в лотерее, отправьте электронное письмо по адресу [email protected]. Вы можете отправить только одно (1) электронное письмо на человека. Заявки, поданные до или после окна лотереи билетов, рассматриваться не будут. Пожалуйста, расскажите нам, почему ВЫ хотели бы стать частью нашей студийной аудитории! Если вас выберут, вы получите определенное количество билетов на случайную дату и время шоу. Участие в лотерее не гарантирует получение билетов, и вы будете уведомлены только в том случае, если вас выберут.

Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson).Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .

На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун. Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.

Билеты не могут быть проданы, выставлены на аукцион или переданы другим лицам.Остерегайтесь билетов, выставленных на продажу, так как они недействительны и не будут приняты. Saturday Night Live и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право АННУЛИРОВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.

К началу страницы


Вы можете зарезервировать бесплатные билеты на запись «Вечернего шоу» с участием Джимми Фэллона, перейдя по адресу: tonightshowtix.com. Все доступные даты будут указаны в календаре.

Мы публикуем даты шоу и заявки на билеты по мере их поступления. Пожалуйста, проверяйте 1iota, чтобы быть в курсе о шоу и наличии билетов. Запросы не могут быть отправлены на даты, которые не опубликованы в календаре. Пожалуйста, обращайтесь к официальной учетной записи The Tonight Show в Твиттере @FallonTix и на этой странице продажи билетов, чтобы быть в курсе информации о дате выпуска билетов.

Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии.Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .

На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун. Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.

Вам нужно будет зарегистрироваться на 1iota, чтобы подать заявку на билеты на вечернее шоу с участием Джимми Фэллона.Мы рекомендуем вам сделать это до выпуска билетов, нажав здесь: Регистрация участников Tonight Show. Когда вы подаете заявку на билеты на «Вечернее шоу с участием Джимми Фэллона», вы автоматически попадаете в список ожидания. На данный момент у вас нет билета. Если мы сможем выполнить ваш запрос на билет, с вами свяжутся через 1iota. Если вы не получили уведомление от 1iota, мы, к сожалению, не смогли выполнить ваш запрос на билеты, и у вас нет билетов

Все билеты бесплатны и не могут быть проданы или выставлены на аукцион.Пожалуйста, напишите на [email protected], если вас просят оплатить билеты. «Вечернее шоу с участием Джимми Фэллона» и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право АННУЛИРОВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.

Резервные карты

Резервные карты теперь доступны в магазине в NBC Studios, расположенном по адресу 30 Rockefeller Plaza (через вход с 6-й авеню между 49-й и 50-й улицами).). Резервные карты будут распространяться с 11:00 до 15:00 по восточному стандартному времени утром в день шоу.

Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson).Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .

Количество мест ограничено! Любой, кто получает карту, должен быть старше 16 лет (независимо от того, присутствует ли родитель или опекун). Резервные карты ограничены одной на человека и выдаются в порядке очереди. Резервные карты не гарантируют вход.

К началу страницы


Вы можете зарезервировать бесплатные билеты на запись шоу Эмбер Раффин на сайте 1iota.ком.

Мы публикуем даты шоу и заявки на билеты по мере их поступления. Пожалуйста, проверяйте 1iota, чтобы быть в курсе о шоу и наличии билетов. Запросы не могут быть отправлены на даты, которые не опубликованы в календаре.

Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .

На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун. Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.

Вам нужно будет зарегистрироваться на 1iota, чтобы подать заявку на билеты на шоу Эмбер Раффин. Мы рекомендуем вам сделать это до выпуска билетов, нажав здесь: Регистрация участника 1iota. Когда вы подаете заявку на билеты на шоу Эмбер Раффин, вы автоматически попадаете в список ожидания. На данный момент у вас нет билета. Если мы сможем выполнить ваш запрос на билет, с вами свяжутся через 1iota.Если вы не получили уведомление от 1iota, мы, к сожалению, не смогли выполнить ваш запрос на билеты, и у вас нет билетов.

Все билеты бесплатны и не могут быть проданы или проданы с аукциона. Шоу Эмбер Раффин и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право АННУЛИРОВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.

Резервные карты

Резервные карты теперь доступны каждое утро с 9:00 до 11:00 по восточному поясному времени на стенде Greeter Stand, расположенном в центре вестибюля 30 Rockefeller Plaza (через улицы 49th и 50th St. входы) прямо перед Большой лестницей. После 11:00 по восточному стандартному времени резервные карты будут доступны в магазине NBC Studios, также расположенном по адресу: 30 Rockefeller Plaza (через вход на 6-й авеню между 49-й и 50-й улицами) до 12:00. После получения пронумерованной резервной карты вам будет предложено вернуться в определенное время в день шоу, чтобы зарегистрироваться и посмотреть, сможем ли мы принять вас для записи на этой неделе. Резервные карты раздаются в течение каждой недели шоу примерно до 1 часа до начала записи.

Для получения дополнительной информации о The Shop и его часах работы посетите веб-сайт The Shop at NBC Studios.

Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Доказательством вакцинации должен быть действительный и утвержденный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства наличия вакцины, не допускаются.

Количество мест ограничено! Любой, кто получает карту, должен быть старше 16 лет (независимо от того, присутствует ли родитель или опекун). Резервные карты ограничены одной (1) на человека и выдаются в порядке очереди. Резервные карты не гарантируют вход.

К началу страницы


Не упустите шанс увидеть Голос в прямом эфире! Подпишитесь на бесплатные билеты, НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ БИЛЕТЫ НА ГОЛОС.

Верх страницы


Связанная с эндоциклом гипертрофия клеток канальцев и пролиферация клеток-предшественников восстанавливают функцию почек после острого повреждения почек

Мыши Pax8/Confetti и мыши Pax2/Confetti

(Pax8/Confetti) или Pax2. Мыши rtTA;TetO.Cre;R26.Confetti (Pax2/Confetti) были получены на полном фоне C57BL/6 путем скрещивания штамма Confetti Gt(ROSA)26Sor tm1(CAG-Brainbow2.1)Cle /J со штаммом TetO.Cre B6.Cg-Tg(TetO-Cre)1Jaw/J , оба приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США). Двойных трансгенных мышей затем скрещивали с мышами Pax8.rtTA ( B6.Cg-Tg(Pax8-rtTA2S*M2)1Koes/J , Jackson Laboratory) или с Pax2.rtTA мышь 14 для получения модели тройной трансгенной индуцируемой мыши. Мышей генотипировали, и в этом исследовании использовали только тройных гемизиготных мышей.

Рекомбинацию трансгена-репортера индуцировали в возрасте 5 недель введением 2 мг/мл или 0,25 мг/мл доксициклина гиклата (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) для мышей Pax8/Confetti и 2 мг/мл доксициклина hyclate для мышей Pax2/Confetti в питьевой воде с добавлением 2,5% сахарозы (Sigma-Aldrich) в течение 10 дней. Введение доксициклина вызывает постоянную рекомбинацию гена, кодирующего один цвет (красный, желтый, зеленый или синий флуоресцентные белки, RFP, YFP, GFP и CFP), при этом клетки GFP встречаются с меньшей частотой, чем другие цвета 12 . Дальнейший результат рекомбинации также может привести к отсутствию мечения флуоресцентного репортера в Cre-экспрессирующих клетках. После индукции мышей выдерживали в периоде вымывания в течение 1 недели, а затем умерщвляли (день 0, T0, n  = 5 для мышей Pax8/Confetti, индуцированных 2 мг/мл доксициклина гиклата, n  = 5 для Pax8 Мышей /Confetti индуцировали 0,25 мг/мл доксициклина гиклата и n  = 4 для мышей Pax2/Confetti), в то время как другую группу содержали в вымывании еще 30 дней (T30), а затем мышей умерщвляли ( n  = 5 для Мыши Pax2/Confetti, n  = 4 мыши Pax8/Confetti, индуцированные 0.25 мг/мл доксициклина гиклата). Дополнительную группу индуцировали доксициклином в течение 10 дней и поддерживали в течение дополнительных 37 дней при непрерывной индукции (доксициклин Т30) (мыши Pax2/Confetti n  = 4). Другую группу мышей Pax2/Confetti ( n  = 3) индуцировали в возрасте 12 недель в течение 10 дней, затем содержали в периоде вымывания в течение 1 недели, а затем умерщвляли. Во всех этих группах число самцов и самок мышей было распределено поровну. Другой экспериментальной группе после периода индукции и вымывания была проведена односторонняя ИРИ 30 минут или внутримышечная инъекция гипертонического глицерина, после чего умерщвление на 30-й день ( n  = 16 для Pax8/Confetti, n  = 11 для Pax2/Конфетти).Мыши с ложной операцией ( n  = 5 мышей Pax2/Confetti, n  = 4 мышей Pax8/Confetti) подверглись той же хирургической процедуре, что и ишемизированные мыши, но у них не было пережатия левой почечной артерии и не было ишемии.

Дополнительную группу мышей Pax2/Confetti индуцировали доксициклином в течение 10 дней, а после периода вымывания мышей подвергали односторонней ИРИ 30’. Через 24 часа после травмы мышам вводили HDACi, трихостатин (TSA, Sigma-Aldrich) 0,5 мг/кг/день в 40 мкл ДМСО в течение 3 недель i.п. ( n  = 4) или 4-фенилбутират (4-PBA, Sigma-Aldrich) 1 г/кг/день в течение 3 недель с питьевой водой ( n  = 4). В контрольной группе ( n  = 4) мышей лечили ДМСО в течение 3 недель. Мышей забивали на 30-й день. Животных с идентичным генотипом и сходным возрастом слепым методом распределяли в экспериментальные группы.

Для проверки наличия в трансгенной системе какого-либо типа утечки или неспецифической экспрессии трансгена мышей Pax8/Confetti и Pax2/Confetti без индукции умерщвляли в Т0 и на 30-й день после IRI ( n  = 3 для каждой трансгенной мыши в каждый момент времени).

Все животные были умерщвлены CO 2 Камера, почки были собраны, инкубированы в 4% параформальдегиде (PFA, Sigma-Aldrich) в PBS (Sigma-Aldrich) в течение 2 ч при 4°C с последующим погружением в 15% растворе сахарозы в PBS в течение 2 ч при 4°C, а затем в 30% растворе сахарозы в PBS в течение ночи при 4°C, затем замораживают.

Мыши Pax8/FUCCI2 и мыши Pax2/FUCCI2

Для визуализации хода клеточного цикла клеток Pax2+ и Pax8+ Pax2.rtTA;TetO.Cre;R26.Использовали мышиные модели FUCCI2 (Pax2/FUCCI2) или Pax8. rtTA;TetO.Cre;R26.FUCCI2 (Pax8/FUCCI2). Для создания двух линий мы скрестили мышей Pax2.rtTA;TetO.Cre или Pax8.rtTA;TetO.Cre с R26R-mCherry-hCdt1(30/120) (CDB0229K) и R26R-mVenus. мыши -hGem(1/110) (CDB0230K) (обе получены из CDB Laboratory for Animal Resources and Genetic Engineering, RIKEN Kobe, Japan, http://www.cdb.riken.jp/arg/reporter_mice.html), которые вместе составляют систему FUCCI2.Таким образом, мы получили четверных трансгенных мышей на полном фоне C57BL/6, которые были генотипированы, как указано в параграфе «Генотипирование».

У полученных мышей после введения доксициклина промотор Pax2 или Pax8 управляет экспрессией флуоресцентного белка mCherry-hCdt1 (30/120) (красный) в ядрах клеток в фазе G1 и флуоресцентного белка mVenus-hGem ( 1/110) (зеленый) в ядрах клеток в фазе S/G2/M. Клетки также могут выглядеть желтыми на границе G1/S, но это очень короткое событие, поэтому желтые клетки встречаются редко.Чтобы вызвать репортерную экспрессию, самцов мышей в возрасте 5 недель обрабатывали 2 мг/мл доксициклина в 2,5% растворе сахарозы в воде ad libidum, затем выдерживали в периоде вымывания в течение 1 недели (T0, Pax2/FUCCI2 n  = 4 , Pax8/FUCCI2 n  = 4). Процент индукции определяли у здоровых мышей как количество клеток, положительных по линии Pax8, экспрессирующих mCherry или mVenus, по отношению к общему количеству клеток канальцев на поле. После периода вымывания мышей подвергали одностороннему ИРИ продолжительностью 30 мин (та же процедура, что и у мышей Конфетти), а затем умерщвляли на 2-й день (Pax2/FUCCI2 n  = 8, Pax8/FUCCI2 n  = 8) и в день 30 (Pax2/FUCCI2 n  = 9, Pax8/FUCCI2 n  = 12).Животных с идентичным генотипом и близким возрастом распределяли в экспериментальные группы слепым методом. Чтобы проверить, проявляет ли трансгенная система какой-либо тип утечки или неспецифическую экспрессию трансгена, мышей Pax8/FUCCI2 и Pax2/FUCCI2 без индукции убивали в Т0 и на 30-й день после IRI ( n  = 3 для каждой трансгенной мыши при каждом момент времени).

Всех животных умерщвляли в камере CO 2 , почки собирали и оценивали с помощью конфокальной микроскопии или проточной цитометрии. Для проведения конфокального анализа почки обрабатывали, как описано для мышей Confetti.

Мыши Pax8/FUCCI2aR и мыши Pax2/FUCCI2aR

FUCCI2aR представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с моделью FUCCI, поскольку он производит изостехиометрические количества обоих зондов FUCCI без наличия «темной фазы» в конце каждой клетки. цикл. Эта более новая модель имеет то преимущество, что оба зонда всегда экспрессируются в одном и том же соотношении, что упрощает обнаружение зелено-красного перехода и позволяет напрямую отслеживать и количественно определять количество меченых клеток с помощью проточной цитометрии с использованием программного обеспечения MACSQuant (Miltenyi Biotec S. .r.l., Болонья, Италия). По этой причине мы скрестили Pax8.rtTA;TetO.Cre ; а также Pax2.rtTA;TetO.Cre ; мышей с мышами, содержащими Cre-зависимый репортер на основе флуоресцентного убиквитина (FUCCI2aR) (European Mouse Mutant Archive (EMMA), INFRAFRONTIER-I3, Neuherberg-München, Germany), который состоит из бицистронного Cre-активируемого репортера из двух флуоресцентные белки, экспрессия которых меняется в зависимости от фазы клеточного цикла: mCherry-hCdt1 (30/120) (красный), экспрессируется в ядрах клеток в фазе G1, и mVenus-hGem (1/110) (зеленый), экспрессируется в ядрах клеток в С/Г2/М. Таким образом, мы получили тройных трансгенных мышей на полном фоне C57BL/6, которые были генотипированы, как указано в параграфе «Генотипирование».

У полученных мышей после введения доксициклина промотор Pax2 или Pax8 управляет экспрессией флуоресцентного белка mCherry-hCdt1 (30/120) (красный) в ядрах клеток в фазе G1 и флуоресцентного белка mVenus-hGem ( 1/110) (зеленый) в ядрах клеток в фазе S/G2/M. Клетки также могут выглядеть желтыми на границе G1/S, но это очень короткое событие, поэтому желтые клетки встречаются редко.

Чтобы вызвать репортерную экспрессию, самцов мышей в возрасте 5 недель обрабатывали 2 мг/мл доксициклина в 2,5% сахарозной воде ad libidum, затем выдерживали в периоде вымывания в течение 1 недели (T0, Pax2/FUCCI2aR n = 4, Pax8/FUCCI2aR n  = 4). Процент индукции определяли у здоровых мышей как количество клеток, положительных по линии Pax8, экспрессирующих mCherry или mVenus, по отношению к общему количеству клеток канальцев на поле. После периода вымывания мышей-самцов подвергали одностороннему ИРИ в течение 30 мин (та же процедура, что и у мышей Конфетти), а затем умерщвляли на 2-й день (Pax2/FUCCI2aR n  = 4, Pax8/FUCCI2aR n  = 4) и в день 30 (Pax2/FUCCI2aR n  = 9, Pax8/FUCCI2aR n  = 9).Животных с идентичным генотипом и близким возрастом распределяли в экспериментальные группы слепым методом. Чтобы проверить, проявляет ли трансгенная система какой-либо тип утечки или неспецифическую экспрессию трансгена, мышей Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR без индукции умерщвляли в Т0 и на 30-й день после IRI ( n  = 3 для каждой трансгенной мыши при каждом момент времени).

Всех животных умерщвляли в камере CO 2 , почки собирали и оценивали с помощью конфокальной микроскопии или проточной цитометрии.Для проведения конфокального анализа почки обрабатывали, как описано для мышей Confetti.

Генотипирование

Биоптаты хвоста инкубировали в течение ночи при 55 °C в лизирующем реагенте (1M Tris-HCl, pH 8,5; 0,5M EDTA, 20% SDS, 4M NaCl, 0,1 мг/мл протеиназы K, нейтрализованной 40 мM Tris -HCl, все от Sigma-Aldrich), центрифугируют и экстрагируют ДНК с использованием изопропанола (Sigma-Aldrich). Чтобы отличить гомозиготность трансгена от гетерозиготности, проводили qRT-PCR с использованием 5 нг/мкл геномной ДНК с помощью LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Роткройц, Швейцария).Реакции проводили с использованием LightCycler® 480 (Roche Diagnostics) с программой, состоящей из 40 циклов, каждый из которых состоял из фазы инициирования при 95°С в течение 15 мин, фазы отжига при 60°С в течение 45 мин и фазы амплификации при 72°С. на 60 мин. Использовали следующие праймеры:

Pax2.rtTA и Pax8.rtTA прямой 5′-AACGCACTGTACGCTCTGTC-3′ и обратный 5′-GAATCGGTGGTAGGTGTCTC-3′; TetO.Cre прямой 5′-TCGCTGCATTACCGGTCGATGC-3′ и обратный 5′-CCATGAGTGAACGAACCTGGTCG-3′. Геномную ДНК TCRα использовали в качестве домашнего хозяйства для относительного количественного определения и амплифицировали с использованием прямого 5′-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3′ и обратного 5′-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3′ праймеров.

Чтобы отличить гомозиготность FUCCI2aR и Confetti от гетерозиготности, ПЦР проводили со следующими праймерами и параметрами: Confetti прямой 5′-GAATTAATTCCGGTATAACTTCG-3′ и обратный 5′-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3′, 3 мин 94 °C, 35 циклов из 30 с 94 °С, 30 с 58 °С, 30 с 72 °С и, наконец, 2 мин 72 °С; FUCCI-P3 5′-TCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTC-3′, FUCCI-P4 5′-AACCCCAGATGACTACCTATCCTCC-3′ и FUCCI-P4 5′-GGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC-3′; 2 мин 96 °C, 35 циклов 96 °C 30 с, 65 °C 30 с и, наконец, 72 °C в течение 30 с.

Реперфузионное повреждение при ишемии почек

Самцов мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (100 мг/кг)/ксилазина (10 мг/кг, Bio98 S.r.L, Милан, Италия), что вызывало кратковременную хирургическую анестезию с хорошим обезболиванием. Животных до операции содержали в тепле в вентилируемой термокамере с температурой 37 °С, а температуру их тела постоянно контролировали ректальным датчиком и поддерживали в диапазоне 36,5–37 °С. Мышь была помещена на термостатическую станцию ​​в положении на правом боку, выбрита и продезинфицирована повидон-йодом с разрезом 1-1.Выполняли 5 см кожи с левой стороны, затем рассекали и вскрывали нижележащий мышечный слой. Затем левую почку выталкивали наружу, выталкивая ее из разреза стерильными ватными тампонами, чтобы обнажить почечную ножку для пережатия. Почечная артерия была пережата, чтобы заблокировать приток крови к почке и вызвать ишемию (заметную по изменению цвета почки с красного на темно-фиолетовый). Длительность ишемии почки начинается с момента пережатия. После проверки изменения окраски почку возвращали в брюшную полость, а животное возвращали в вентилируемую нагревательную камеру.Длительность ишемии составила 30 мин, после чего зажим сняли для начала реперфузии, о чем свидетельствует изменение цвета почки обратно на красный. Мышечный слой ушивали с последующим закрытием кожной раны металлическими скобами. Сразу после закрытия раны каждой мыши вводили подкожно 0,5 мл теплого стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl) для регидратации. Правая контралатеральная почка оставалась нетронутой в качестве контроля.

Мышам с плацебо-операцией была проведена та же хирургическая процедура, что и выше, но у них не было пережатия левой почечной артерии и ишемии.

Нефротоксическое ОПП

Трансгенных самок мышей индуцировали в течение 10 дней доксициклином, выдерживали 1 неделю в режиме вымывания, после чего проводили индуцированную рабдомиолизом ОПП путем внутримышечной инъекции в день 0 гипертонического глицерина (8 мл/кг массы тела 50% раствор глицерина; Sigma-Aldrich) в нижние задние конечности.

Чрескожное измерение скорости клубочковой фильтрации

Измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) проводилось, как описано в другом месте 42 .Вкратце, мыши ( n  = 9 ишемизированных мышей Pax2/Confetti, n  = 13 ишемизированных мышей Pax8/Confetti, n  = 5 мышей Pax8/Confetti с ложной операцией, netti-5 Pax=2/Confetti   . оперированные мыши, n  = 5 здоровых мышей Pax8/Confetti, n  = 5 здоровых мышей Pax2/Confetti, n  = 7 мышей Pax8/Confetti, получавших глицерин, n  8 мышей, получавших глицерин Pax2= , n  = 7 ишемических мышей Pax2/Confetti, обработанных ДМСО, n  = 6 обработанных PBS, n  = 7 обработанных TSA, n  = 6 обработанных PBA, где) Устройство, состоящее из двух светодиодов, фотодиода и батареи (Mannheim Pharma and Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия), крепили с помощью двусторонней клейкой ленты на шею выбритых животных.На время записи (~1,5 часа) каждое животное находилось в сознании и содержалось в одной клетке. Перед внутривенным введением 150 мг/кг ФИТЦ-синистрина (Mannheim Pharma and Diagnostics GmbH) фоновый сигнал кожи регистрировали в течение 5 мин. После удаления устройства визуализации данные были проанализированы с использованием программного обеспечения MPD Studio версии RC6 (MediBeacon GmbH Cubex41, Мангейм, Германия) 43 . СКФ [мкл/мин] рассчитывали по снижению интенсивности флуоресценции с течением времени (т. е. по периоду полувыведения FITC-синистрина из плазмы) с использованием двухкамерной модели, массы тела животных и эмпирического коэффициента пересчета.Для каждой временной точки значение СКФ нормализовали по исходному значению и по ложному (для мышей с ишемией) или по значению здоровых мышей сопоставимого возраста и веса (для мышей, получавших глицерин). На основании результатов, полученных в предварительных экспериментах по оценке вариабельности измерения СКФ, в исследование были включены только мыши, показавшие снижение СКФ после ОПП не менее чем на 20% по сравнению с исходным уровнем.

Оценка азота мочевины крови

Функцию почек оценивали путем сбора небольшого количества крови у мышей ( n  = 5 ишемизированных мышей Pax8/Confetti, n  = 5 мышей Pax8/Confetti, ложно оперированных, 0 n = 6 мышей Pax8/Confetti, обработанных глицерином, n  = 5 здоровых мышей Pax8/Confetti, n  = 8 мышей Pax2/Confetti, обработанных глицерином, n  = 5 здоровых мышей Pax2/Confetti) с металлическим ланцетом поднижнечелюстного сплетения в разные моменты времени для измерения уровня мочевины мочевины.Параметры крови измеряли в образцах плазмы с антикоагулянтом ЭДТА с использованием набора Urea FS (DiaSys Diagnostic Systems, Holzheim, Germany) в соответствии с протоколами производителя.

Оценка повреждения почек

Здоровые и ишемизированные почки, хранившиеся в 4% забуференном формалине, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 2–4 мкм для периодического окрашивания кислотой–Шиффом (PAS). Ишемическое повреждение канальцев и рубцевание оценивали путем оценки процента канальцев во внешней полосе наружного мозгового вещества, в которых наблюдался клеточный некроз, дилатация канальцев или образование слепков (травма), атубулярных отделов с обильными неорганизованными клетками паренхимы и клеточными инфильтратами (рубцевание). Анализировали 24 почки мышей Pax2/Confetti и 4 поля (20×) на почку. Все оценки проводились слепым наблюдателем.

Иммунофлуоресцентная и конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия выполнялась на срезах тканей почек толщиной 10 мкм с использованием конфокального микроскопа Leica SP5 AOBS (Leica, Wetzlar, Germany), оснащенного двухфотонным лазером Chameleon Ultra-II (Coherent, Milan, Италия).

Использовали следующие антитела: анти-аквапорин-1 (AQP1, AB2219, разведение 1:100, Millipore, Darmstadt, Germany), анти-Tamm-Horsfall (THP, CL1032A, разведение 1:20, Cederlane, Burlington, Ontario) , Канада), анти-аквапорин-2 (AQP2, C-17, SC-9882, разведение 1:25, Santa Cruz Biotechnology, Сент-Луис, США), антимегалин (P-20, sc-16478, разведение 1: 25, Santa Cruz Biotechnology), биотинилированный лектин лотоса, LTA (B-1325, разведение 1:50, Vector Laboratories, Burlingame, USA), анти-KIM-1 (AF1817, разведение 1:40, R&D Systems, Inc., Миннеаполис, США), анти-Pax2 (71–6000, разведение 1:25, Zymed, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) анти-Ki-67 (ab15580, разведение 1:50, Abcam, Кембридж, Великобритания), анти- GFP-488 (A21311, разведение 1:100, Life Technologies, Монца, Италия), антифосфорилированный гистон 3 (p-h4, ab14955, разведение 1:2000, Abcam), антициклинзависимая киназа 4 (CDK4, SC- 601, разведение 1:50, Santa Cruz Biotechnology) и фаллоидин-633 (A22284, разведение 1:40, Life Technologies). Вторичные антитела Alexa-Fluor были получены от Molecular Probes (Life Technologies).Для выявления канальцев проводили окрашивание фаллоидином Alexa Fluor 546 (A22283, разведение 1:40, Molecular Probes, Life Technologies). Для мышей Pax8/Confetti и для мышей Pax2/Confetti приобретение было установлено в голубых, зеленых, желтых и красных длинах волн с использованием возбуждения с длинами волн 405, 488, 514 и 543 нм соответственно. Для мышей Pax8/FUCCI2, мышей Pax2/FUCCI2, Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR сбор данных осуществляли в зеленой и красной длинах волн с использованием возбуждения 488 и 543 нм соответственно.Эмиссия mCherry собиралась через 570/620 нм BP. Ядра контрастировали DAPI (62248, разведение 1:1000, Life Technologies) с возбуждением двухфотонным лазером Chameleon Ultra-II на длине волны 800 нм.

Площадь клеточной поверхности не менее 20 клеток mCherry+p-h4− и 20 клеток mCherry+p-h4+ для каждой мыши Pax8/FUCCI2aR измеряли с помощью программного обеспечения Image J. Одно поле: 620 × 620 мкм.

Трехмерная реконструкция

Для создания трехмерных изображений (рис. 4g–i) и дополнительного фильма 1 использовалось программное обеспечение для обработки изображений Leica Microsystems «Leica Application Suite X».Стопки Z-серии были получены из срезов почек толщиной 40 мкм, поскольку эта толщина является пределом для окрашивания всех ядер с помощью DAPI, что позволяет проводить подсчет клеток. Изображения собирались с интервалом в 1 мкм. Клоны наблюдались в каждом цвете, но для 3D-реконструкции мы выбрали в основном желтые, потому что YFP распределяется по всей ячейке, что упрощает построение и оценку 3D-реконструкции.

Для сравнения 2D- и 3D-анализа два слепых наблюдателя подсчитали количество клонов в 2D-изображениях и в 3D-реконструкции.Процент клоногенных клеток рассчитывали, как указано ниже (уравнение 2).

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия для PCNA была проведена на залитых парафином срезах здоровых и ишемизированных почек ( n  = 5 на 0-й день, n  = 5 на 2-й и 30-й день после IRI), как подробно описано в другом месте 4 . Вкратце, после удаления парафина и регидратации в воде срезы ткани погружали в 3% H 2 O 2 на 10 мин для блокирования активности эндогенной пероксидазы.Целевой антиген извлекали путем обработки срезов в микроволновой печи в цитратно-натриевом буфере (10  мМ, pH 6). Образцы нагревали в микроволновой печи при 800 Вт в течение 3 мин, а затем в течение 7 мин при 400 Вт. Срезы охлаждали в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого повторяли 10-минутную процедуру нагревания со свежим буфером. Срезы предварительно инкубировали в течение 30 мин в 1× PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% сапонина, а затем инкубировали в течение 15 мин при 37°С и в течение ночи при 4°С с мышиным анти-PCNA (PC10, ab29, разведение 1). :300, Абкам).Затем срезы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными биотинилированными антителами против IgG мыши, после чего инкубировали с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (набор Vectatain ABC, Vector Laboratories) в течение 30 минут и 3-амино-9- этилкарбазол (AEC, Vector Laboratories) (красный цвет) в качестве субстрата пероксидазы в течение 20 мин. Срезы контрастировали эозином G (Bioptica, Милан, Италия).

Анализ частоты клонирования

Одноклеточные клоны и клоны с двумя или более клетками подсчитывали в канальцах AQP2- внешней полоски наружного мозгового вещества у мышей Pax8/Confetti в день 0 (T0), в контрольной группе того же возраста (T30 ), при ложной операции, при ишемии почек (IRI T30) и при нефротоксических почках (Gly T30).{\ circ} \, {\ mathrm {из}} \, {\ mathrm {клоны}}) \ раз 100, $ $

(1)

, где 1 ≤  n  ≤ 11 у мышей Pax8/Confetti, поскольку это максимальный наблюдаемый размер клона.

Те же расчеты были выполнены на мышах Pax2/Confetti при T0, T30, ложнооперированных и IRI T30, где 2 ≤  n  ≤ 10 (рис. 3f)

внешний мозговой мозг, взятый по меньшей мере из пяти срезов каждой мыши, подсчитывали два независимых слепых наблюдателя.{11} {\ left( {\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составленные}} \, {\ mathrm {из}} \, {{n}} \, {\ mathrm {ячейки}} \ , {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {IRI}} \, {\ mathrm {T30}}} — {{\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составлен}} \, {\ mathrm {of}}\,{{n}}\,{\mathrm{ячейки}}\,{\mathrm{at}}\,{\mathrm{T0}}} \right)},$$

, где 2 ≤  n  ≤ 11 у мышей Pax8/Confetti, поскольку максимальный наблюдаемый размер клона составляет 11 клеток. {+}} {\ mathrm {cells}} \, {\ mathrm {в}} \, {\ mathrm {T0}} \ справа) \ раз 100.$$

(2)

Те же расчеты были выполнены на мышах Pax2/Confetti, где 2 ≤  n  ≤ 10 (рис. 3j).

Те же расчеты были выполнены на мышах Pax8 и Pax2 Confetti через 30 дней после нефротоксического ОПП (Gly T30, рис. 1l, рис. 3n).

Те же расчеты были выполнены для 3D-анализа у мышей Pax8 и Pax2 Confetti при IRI T30 (рис. 4f)

Весь анализ был выполнен в канальцевых клетках, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества.{11} [\ влево ({\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составленные}} \, {\ mathrm {из}} \, {{n}} \, {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {IRI}} \, {\ mathrm {T30}} — {\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составлен}} \, {\ mathrm {из} } \, {{n}} \, {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {T0}} \right) \ times {{n}}], $ $

, где 2 ≤  n  ≤ 11 у мышей Pax8/Confetti, поскольку максимальный наблюдаемый размер клона составляет 11 клеток.

(D) n ° новых клеток Pax8+ при IRI T30 =  n ° клеток Pax8+, включенных в новые клоны– n ° клеток, давших начало новым клонам*

* n° 1 из 95 клеток что возникли новые клоны, совпадает с n ° новых клонов при ИРИ Т30 (А), поскольку каждый клон является потомством одной клетки.{+} {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm T0}) \ раз 100. $ $

(3)

Те же расчеты были выполнены для мышей Pax8/Confetti после нефротоксического ОПП (рис. 1k) и для мышей Pax2/Confetti на 30-й день после IRI (рис. 3g). У мышей Pax2/Confetti 2 ≤  n  ≤ 10.

Весь анализ проводили в канальцевых клетках, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества. Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.{+} {\mathrm{ячейки}}\,{\mathrm{at}}\,{\mathrm{T}}0} \right) \times 100} \right].$$

(4)

Те же расчеты были выполнены для мышей Pax8/Confetti после ишемического ОПП (рис. 3i) и для мышей Pax2/Confetti и Pax8/Confetti после нефротоксического ОПП (рис. 3m).

Весь анализ был проведен в канальцевых клетках, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества. Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.{+} {\mathrm {ячейки}}\,{\mathrm {at}}\,{\mathrm {T}}0} \right) \times 100} \right] — 100.$$

(5)

Те же расчеты были выполнены для мышей Pax8/Confetti после ишемического ОПП (рис. 3k) и для мышей Pax2/Confetti и Pax8/Confetti после нефротоксического ОПП (рис. 3o).

Все анализы проводились на клетках канальцев, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных на AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества. Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.{+} {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {IRI}} \, {\ mathrm {T30}}} \right) \ times 100} \right].$ $

(6)

Те же расчеты были выполнены для клеток Pax2- (рис.  5e). Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.

Частота клонов Pax2+

Этот анализ проводили в коре головного мозга после иммуноокрашивания мегалином, в OSOM после иммуноокрашивания AQP1 и THP и в собирательных трубочках после иммуноокрашивания AQP2.{+} {\mathrm {клоны}}\end{массив}.$$

n ° новых клонов определяли на основе расчета, использованного в формуле A.

(G) частота клонов Pax2+ (% ) в каждом сегменте нефрона и в собирательных трубочках=

$$\left( {A/F} \right) \times 100.$$

(7)

Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии

Анализ клеточного цикла проводили на всех клетках FUCCI2 и на всех клетках FUCCI2aR (клетки mCherry+ и mVenus+) у мышей Pax8/FUCCI2, у мышей Pax2/FUCCI2, у мышей Pax8/FUCCI2aR и у мышей Pax8/FUCCI2aR Мыши Pax2/FUCCI2aR через 2 дня и через 30 дней после ИРИ.

Почки Pax8/FUCCI2, Pax8/FUCCI2aR, Pax2/FUCCI2 и Pax2/FUCCI2aR обрабатывали для получения суспензии отдельных клеток и проведения анализа клеточного цикла с помощью проточной цитометрии. Для этого почки измельчали ​​скальпелем. После добавления 1,5 мл буфера для расщепления (300 ЕД/мл коллагеназы II и 1 мг/мл проназы Е, Sigma-Aldrich) их инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Раствор пипетировали вверх и вниз срезанным наконечником пипетки на 1000 мкл каждые 5 мин. Расщепленные почки осторожно продавливали через градуированное сито (150 меш, Sigma-Aldrich) и поток тщательно промывали HBSS (Life Technologies).После центрифугирования супернатанты удаляли, а осадки снова переваривали буфером для расщепления при 37°С в течение 20 мин. В течение этого инкубационного периода суспензии разрезали иглой 27-G. Эритроциты лизировали 0,8% Nh5Cl. Суспензии одиночных клеток фиксировали 1% PFA в течение 1 ч при комнатной температуре и 70% этанолом в течение ночи. Затем клетки окрашивали, как описано в другом месте 45 . После инкубации с анти-DsRed pAb (632496, разведение 1:25, Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния, США) или изотипическим контролем следовала инкубация с козьим антикроличьим антителом Alexa Fluor 647 в качестве вторичного антитела для обнаружения клеток mCherry+, тогда как для обнаружения клеток mCherry+ Клетки mVenus+ использовали pAb против GFP-488 (A21311, разведение 1:100, Life Technologies). Затем клетки инкубировали с DAPI для проведения анализа содержания ДНК. Чтобы проверить, были ли получены аналогичные результаты после истощения клеток AQP2+, почки мышей Pax8/FUCCI2 ( n  = 3) обрабатывали, как указано выше, и клетки фиксировали 1% PFA в течение 1 часа при комнатной температуре. Аликвоту клеток инкубировали с pAb против AQP2 (bs-4611R, разведение 1:20, Bioss Inc., Woburn, Massachusetts) или с изотипическим контролем и с козьим антикроличьим антителом Alexa Fluor 647 в качестве вторичного антитела (Life Technologies).Оставшуюся часть клеток инкубировали с pAb против AQP2 (bs-4611R, разведение 1:20, Bioss Inc.), затем с микрогранулами MicroBeads против кроликов (Miltenyi Biotec Srl), затем пропускали через колонки для МС (Miltenyi Biotec Srl) соответственно. с протоколом производителя и сбором первого протока, содержащего немеченые клетки, чтобы выполнить истощение клеток AQP2+ с помощью магнитных ячеек. Небольшую часть как истощенных, так и неистощенных клеточных фракций AQP2 окрашивали AQP2 pAb (bs-4611R, разведение 1:20, Bioss Inc. ), затем в качестве вторичного антитела использовали козье антикроличье антитело Alexa Fluor 647, а затем анализировали с помощью прибора Cytoflex S (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния) с программным обеспечением CytExpert. AQP2-истощенную клеточную фракцию фиксировали 70% этанолом в течение ночи и на следующий день окрашивали анти-DsRed pAb (632496, разведение 1:25, Clontech) и анти-GFP pAb (A21311, разведение 1:100, Life Technologies) как выше для оценки клеток mCherry+ и mVenus+. В каждом эксперименте анализировали более 50 000 событий с использованием прибора FACS LSRII (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) с программным обеспечением FACSDiva или с помощью прибора Cytoflex S (Beckman Coulter) с программным обеспечением CytExpert.В экспериментах с мышами Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR было проанализировано более 50 000 событий с использованием прибора FACS LSRII (BD Biosciences) и прибора MacsQuant (Miltenyi Biotec S.r.l.). Оценку общего количества клеток Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR проводили с использованием прибора MacsQuant (Miltenyi Biotec S. r.l.). Вторичное антитело Alexa Fluor 647 возбуждали лазерной линией 633 нм, GFP pAb возбуждали лазерной линией 488 нм, DAPI возбуждали УФ-лазером 355 нм.

Ткани

В общей сложности 5 здоровых почек (4 мужчины и 1 женщина, средний возраст 56,2 ± 11 лет) и 10 биоптатов почек пациентов (средний возраст 43,7 ± 7,2 года), у которых развилась ХБП после ОПП, были проанализированы в соответствии с Этическим комитетом. об экспериментах на людях Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi и Детской университетской больницы Мейера, Флоренция, Италия. Нормальные фрагменты почки получали с полюса, противоположного опухоли, у больных, перенесших нефрэктомию по поводу локализованных опухолей почки.Формальные согласия были получены донорами или родственниками. Стадия ОПП была классифицирована в соответствии с рекомендациями KDIGO 46 .

Список пациентов с ХБП после ОПП, проанализированных в этом исследовании, представлен в Таблице 1. , Тарритаун, штат Нью-Йорк, США) в сочетании с Phalloidin-546 (A22283, разведение 1:40, Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.

Разрешение на исследование

Эксперименты на животных были одобрены Институциональным наблюдательным советом, Министерством здравоохранения Италии и Комитетом по этике «Regierung von Oberbayern» и проводились в соответствии с институциональными, региональными и государственными инструкциями и в соответствии с Руководство Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Мышей содержали в специальном помещении, свободном от патогенов, со свободным доступом к пище и воде и 12-часовым циклом день/ночь.

Статистический анализ

Результаты были выражены как среднее  ± SEM. Сравнение между группами выполняли с помощью критерия Манна-Уитни U или посредством дисперсионного анализа для множественных сравнений (ANOVA для повторных измерений) с апостериорным анализом Тьюки. p  < 0,05 считалось статистически значимым.

Доступность данных

Авторы заявляют, что все данные, подтверждающие результаты этого исследования, доступны в статье и ее дополнительных информационных файлах или у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *