24 августа 1998 |
США
|
||
28 августа 1998 |
США
|
3 572 955 чел.![]() |
|
9 сентября 1998 |
Франция
Кинофестиваль в Довиле |
|
|
12 ноября 1998 |
Австралия
|
||
26 ноября 1998 |
Новая Зеландия
|
|
|
10 декабря 1998 |
Германия
|
77 235 чел.![]() |
|
10 декабря 1998 |
Израиль
|
|
|
11 декабря 1998 |
Швейцария
Немецкоговорящие регионы |
||
18 декабря 1998 |
Австрия
|
||
18 декабря 1998 |
Испания
|
499 138 чел.![]() |
|
18 декабря 1998 |
Турция
|
|
|
14 января 1999 |
Словакия
|
||
15 января 1999 |
Швеция
|
46 116 чел.![]() |
|
22 января 1999 |
Великобритания
|
44 785 чел.![]() |
|
12 февраля 1999 |
Греция
|
||
12 февраля 1999 |
Исландия
|
||
25 февраля 1999 |
Сингапур
|
||
8 апреля 1999 |
Нидерланды
|
4 586 чел.![]() |
|
9 апреля 1999 |
Финляндия
|
26 772 чел. |
|
23 апреля 1999 |
Дания
|
9 784 чел. |
|
23 апреля 1999 |
Колумбия
|
||
21 мая 1999 |
Норвегия
|
||
26 июня 1999 |
Япония
|
||
14 июля 1999 |
Франция
|
117 764 чел.![]() |
|
28 июля 1999 |
Бельгия
|
28 900 чел.![]() |
|
26 августа 1999 |
Венгрия
|
42 692 чел.![]() |
|
18 ноября 1999 |
Аргентина
|
||
19 ноября 1999 |
Италия
|
32 980 чел.![]() |
|
30 июня 2000 |
Польша
|
44 507 чел.![]() |
|
7 февраля 2015 |
Германия
Берлинский международный кинофестиваль |
||
6 марта 2015 |
Мексика
|
||
27 марта 2015 |
Великобритания
|
||
4 апреля 2015 |
Турция
|
||
24 апреля 2015 |
США
|
||
30 апреля 2015 |
США
|
||
29 мая 2015 |
США
|
||
2 июня 2015 |
США
|
||
7 июня 2015 |
США
|
||
13 июня 2015 |
Австралия
|
||
27 июня 2015 |
Великобритания
|
||
17 июля 2015 |
Новая Зеландия
Международный кинофестиваль в Новой Зеландии |
||
28 июля 2015 |
Польша
Международный кинофестиваль «Новые горизонты» |
||
2 октября 2015 |
Греция
Кинофестиваль в Афинах |
||
9 декабря 2015 |
Франция
|
||
14 января 2016 |
Германия
|
||
26 февраля 2016 |
Сербия
|
||
8 сентября 2016 |
Венгрия
|
||
28 сентября 2018 |
Сингапур
|
||
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||
Кассовые сборы уик-эндов (США)
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Первый уик-энд → |
Видео записи выступлений вокалистов студии «ARTIST», видео клипы.
Видео записи выступлений вокалистов студии «АРТИСТ», видео клипы.
Песня «Мамина улыбка» муз.

Студия Эстрадного Вокала «АРТИСТ» С Новым Годом 2018
ГИМН ВОКАЛЬНОЙ СТУДИИ АРТИСТ
Песня «Возмемся за руки друзья» муз.

Песня «Лето ла-ла» Жукова Дарья
Студия эстрадного вокала АРТИСТ (г.

ВИДЕО-РОЛИК АРТИСТ
Этот веб-сайт использует файлы cookie для улучшения взаимодействия с пользователем. Мы используем файлы cookie в соответствии с нашей Политикой конфиденциальности.
Политика конфиденциальности и использования файлов cookie
Ошибка MSBuild MSB8036 — MSBuild
- Статья
- 2 минуты на чтение
Полезна ли эта страница?
да Нет
Любая дополнительная обратная связь?
Отзыв будет отправлен в Microsoft: при нажатии кнопки отправки ваш отзыв будет использован для улучшения продуктов и услуг Microsoft.Политика конфиденциальности.
Представлять на рассмотрение
Спасибо.
В этой статье
Windows SDK « версия » не найден
Эта ошибка возникает, когда Visual Studio или MSBuild не могут найти Windows SDK, запрошенный вашим проектом, в ожидаемом месте.
Версия Windows SDK, указанная в проекте
Если вы создаете проект в Visual Studio, первое, что нужно проверить, — это то, что проект предназначен для правильной версии Windows SDK.Щелкните правой кнопкой мыши узел проекта и выберите Properties или нажмите Alt + Enter . Появится диалоговое окно Страницы свойств для вашего проекта. В разделе Свойства конфигурации > Общие найдите Windows SDK версии . Например, это может быть 10 (последняя установленная версия) , что выбирает самую последнюю версию, если установлено более одной версии. Если вы выберете раскрывающийся список, вы увидите конкретные версии, обнаруженные Visual Studio. Убедитесь, что выбрана нужная вашему проекту версия.
Если вы используете MSBuild напрямую, а не с Visual Studio, вам следует проверить места, где может быть установлено свойство WindowsTargetPlatformVersion
. Обычно он находится в файле проекта, но также может быть в импортированном файле или в файле глобальных настроек, таком как Directory.build.props . Этот файл может находиться в любом месте родительского пути к вашему проекту, вплоть до корня диска. Параметр по умолчанию во вновь созданном файле проекта выглядит следующим образом:
10.0
Также проверьте сценарии сборки или задания CI, которые вызывают MSBuild. Убедитесь, что командная строка не передает недопустимое значение для этого свойства.
Установите или переустановите Windows SDK
Если это не решит проблему, установите или переустановите версию Windows SDK, необходимую вашему проекту. Вы можете установить определенные версии Windows SDK с помощью установщика Visual Studio. Выберите версию в Отдельные компоненты .Вы также можете загрузить Windows SDK из Центра разработки для Windows.
См. также
Фронт-офис
Проверяйте здесь периодические объявления от администраторов форума и обсуждения сайта в целом. |
513 сообщений |
Последнее сообщение от Thrasher |
|
РАЗГОВОР правильный
Обсуждения, связанные с The Price is Right, можно найти здесь! Новости, информация, обзоры, международные версии, заявки на билеты, запись митапов! Цена ЗДЕСЬ! |
161582 Сообщений |
Последнее сообщение от blozier2006 |
|
Цена правильная Резюме!
Резюме, резюме и обсуждение каждого первого эпизода знаменательного 50-го сезона Price! |
1135 сообщений |
Последнее сообщение от SeaBreeze341 |
|
Цена БЫЛА ПРАВИЛЬНОЙ
Резюме и обсуждения прошлых эпизодов TPiR из предыдущих сезонов! |
1871 сообщений |
Последнее сообщение от harvsoul |
|
Детские доски : Эра Кэри, Эра Баркера, Ночные версии, Эра Каллена, Международная версия | |||
Цена правильная Коллекция видео
У вас есть видео, которым вы хотите поделиться с нами? Используйте этот форум, чтобы вставлять видео с Youtube и т. |
9345 сообщений |
Последнее сообщение от OneBidTris |
|
CSS — Демонстрация чата Showoff
Здесь вы можете узнать, кто сделал лучшую ставку в нашей игре CSS.Присоединяйтесь к этой игре в прямом эфире каждый будний день в дневном чате Golden-Road.net, организованном Wayoshi. |
19951 сообщений |
Последнее сообщение от Wayoshi |
|
FPG — пятничная игра-предсказание
Присоединяйтесь к нам, поскольку мы пытаемся использовать линейку игр этой недели, чтобы определить пятничную линейку, организованную OneBidTris. |
4612 Сообщений |
Последнее сообщение от OneBidTris |
|
Разместите свой собственный!
Думаете, у вас есть все необходимое, чтобы стать следующим ведущим шоу «Цена верна»? Попробуйте свои силы, организовав собственную фиктивную игру TPIR, и играйте так же, как в шоу! Кроме того, наслаждайтесь играми прошлого с разрозненными моделями и комментаторами CU, сумасшедшими настройками Мэллори и ilovesuperball…ну все. |
48442 Сообщений |
Последнее сообщение от Alfonzo |
Билеты и тур по студии — NBC.com
Для получения подробной информации ознакомьтесь с отдельными шоу ниже:
Билеты на шоу NBC, записанные в Нью-Йорке, больше не доставляются по почте.Вся информация о билетах NBC (для Нью-Йорка) подробно описана в нашей линии билетов (212) 664-3056.
America’s Got Talent возвращается, и билеты в зрительный зал БЕСПЛАТНЫ! Присоединяйтесь к ведущему Терри Крюсу и судьям Хоуи Манделу, Габриэль Юнион, Джулианне Хаф и Саймону Коуэллу, когда соревнуются лучшие исполнители-любители страны. Приобретайте билеты на концерты в Лос-Анджелесе прямо сейчас. НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ БИЛЕТЫ НА AMERICA’S GOT TALENT!
К началу страницы
Не упустите шанс увидеть захватывающую игру American Ninja Warrior LIVE! НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПРИОБРЕСТИ БИЛЕТЫ НА AMERICAN NINJA WARRIOR!
К началу страницы
Вы можете зарезервировать бесплатные билеты на запись «Поздней ночи с Сетом Мейерсом», перейдя по адресу: 1iota.ком.
Мы публикуем даты шоу и заявки на билеты по мере их поступления. Пожалуйста, проверьте 1iota, чтобы быть в курсе о шоу и наличии билетов. Запросы не могут быть отправлены на даты, которые не опубликованы в календаре.
Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .
На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун.Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.
Вам нужно будет зарегистрироваться на 1iota, чтобы подать заявку на билеты на «Позднюю ночь с Сетом Мейерсом». Мы рекомендуем вам сделать это до выпуска билетов, нажав здесь: Регистрация участника 1iota. Когда вы подаете заявку на билеты на «Позднюю ночь с Сетом Мейерсом», вы автоматически попадаете в список ожидания. На данный момент у вас нет билета. Если мы сможем выполнить ваш запрос на билет, с вами свяжутся через 1iota.Если вы не получили уведомление от 1iota, мы, к сожалению, не смогли выполнить ваш запрос на билеты, и у вас нет билетов.
Все билеты бесплатны и не могут быть проданы или проданы с аукциона. Late Night with Seth Meyers и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право ОТЗЫВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.
Резервные карты
Резервные карты теперь доступны каждое утро с 9:00 до 11:00 по восточному стандартному времени на стойке приветствия, расположенной в центре вестибюля 30 Rockefeller Plaza (через 49-ю и 50-ю улицу.входы) прямо перед Большой лестницей. После 11:00 по восточному поясному времени резервные карты будут доступны в магазине NBC Studios, также расположенном по адресу: 30 Rockefeller Plaza (через вход с 6-й авеню между 49-й и 50-й улицами) до 13:30. После получения пронумерованной резервной карты вам будет предложено вернуться в определенное время во второй половине дня, чтобы зарегистрироваться и посмотреть, сможем ли мы принять вас для записи во второй половине дня. Резервные карты раздаются утром перед записью каждого шоу.
Для получения дополнительной информации о The Shop и его часах работы посетите веб-сайт The Shop at NBC Studios.
Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen).Доказательством вакцинации должен быть действительный и утвержденный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства наличия вакцины, не допускаются.
Количество мест ограничено! Любой, кто получает карту, должен быть старше 16 лет (независимо от того, присутствует ли родитель или опекун). Резервные карты ограничены одной (1) на человека и выдаются в порядке очереди. Резервные карты не гарантируют вход.
К началу страницы
Смотрите Little Big Shots LIVE бесплатно. НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПРИОБРЕСТИ БИЛЕТЫ НА LITTLE BIG SHOTS.
К началу страницы
Тур по NBC Studios приостановлен до дальнейшего уведомления. Пожалуйста, следите за обновлениями.
Посмотрите студии, в которых снимаются ваши любимые шоу, такие как «Субботним вечером в прямом эфире», «Вечернее шоу с участием Джимми Фэллона», «Поздняя ночь» с Сетом Мейерсом, «Ночные новости NBC» с Лестером Холтом и другие.
Помимо эксклюзивного доступа в студию, страница NBC проведет вас по историческим залам 30 Rockefeller Plaza, где вы сможете заглянуть за кулисы процесса производства телепрограмм. Вы узнаете о написании сценариев, продюсировании и о том, как телевизионный контент попадает к вам домой.
Затем испытайте все это на собственном опыте, посетив нашу Tour Studio и создав собственное шоу, которое вы можете бесплатно скачать и поделиться с друзьями и семьей.
Экскурсия по NBC Studios начинается и заканчивается в магазине NBC Studios, где вы можете найти эксклюзивную одежду, предметы коллекционирования и многое другое из ваших любимых шоу NBC.Магазин расположен на уровне вестибюля 30 Rock на Avenue of the Americas/6th Ave между 49-й и 50-й улицами.
Получите информацию о билетах и ценах на сайте www.TheTouratNBCStudios.com или по телефону 212-664-3700. Тур в NBC Studios проводится ежедневно с 8:20 до 14:00 с понедельника по пятницу и с 8:20 до 17:00 в субботу и воскресенье. Тур в NBC Studios соответствует требованиям ADA и доступен для гостей с разными способностями.
К началу страницы
Розыгрыш билетов в субботу вечером в прямом эфире на сезон 2021-2022 закрыт. Розыгрыш билетов на сезон 2022-2023 гг. начнется в 00:00 по восточному стандартному времени 1 августа 2022 г. и продлится до 23:59 по восточному поясному времени 31 августа 2022 г. Чтобы принять участие в лотерее, отправьте электронное письмо по адресу SNLTICKETS@NBCUNI.COM. Вы можете отправить только одно (1) электронное письмо на человека. Заявки, поданные до или после окна лотереи билетов, рассматриваться не будут. Пожалуйста, расскажите нам, почему ВЫ хотели бы стать частью нашей студийной аудитории! Если вас выберут, вы получите определенное количество билетов на случайную дату и время шоу. Участие в лотерее не гарантирует получение билетов, и вы будете уведомлены только в том случае, если вас выберут.
Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson).Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .
На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун. Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.
Билеты не могут быть проданы, выставлены на аукцион или переданы другим лицам.Остерегайтесь билетов, выставленных на продажу, так как они недействительны и не будут приняты. Saturday Night Live и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право АННУЛИРОВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.
К началу страницы
Вы можете зарезервировать бесплатные билеты на запись «Вечернего шоу» с участием Джимми Фэллона, перейдя по адресу: tonightshowtix.com. Все доступные даты будут указаны в календаре.
Мы публикуем даты шоу и заявки на билеты по мере их поступления. Пожалуйста, проверяйте 1iota, чтобы быть в курсе о шоу и наличии билетов. Запросы не могут быть отправлены на даты, которые не опубликованы в календаре. Пожалуйста, обращайтесь к официальной учетной записи The Tonight Show в Твиттере @FallonTix и на этой странице продажи билетов, чтобы быть в курсе информации о дате выпуска билетов.
Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии.Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .
На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун. Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.
Вам нужно будет зарегистрироваться на 1iota, чтобы подать заявку на билеты на вечернее шоу с участием Джимми Фэллона.Мы рекомендуем вам сделать это до выпуска билетов, нажав здесь: Регистрация участников Tonight Show. Когда вы подаете заявку на билеты на «Вечернее шоу с участием Джимми Фэллона», вы автоматически попадаете в список ожидания. На данный момент у вас нет билета. Если мы сможем выполнить ваш запрос на билет, с вами свяжутся через 1iota. Если вы не получили уведомление от 1iota, мы, к сожалению, не смогли выполнить ваш запрос на билеты, и у вас нет билетов
Все билеты бесплатны и не могут быть проданы или выставлены на аукцион.Пожалуйста, напишите на ticket@tonightshow.com, если вас просят оплатить билеты. «Вечернее шоу с участием Джимми Фэллона» и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право АННУЛИРОВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.
Резервные карты
Резервные карты теперь доступны в магазине в NBC Studios, расположенном по адресу 30 Rockefeller Plaza (через вход с 6-й авеню между 49-й и 50-й улицами).). Резервные карты будут распространяться с 11:00 до 15:00 по восточному стандартному времени утром в день шоу.
Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson).Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .
Количество мест ограничено! Любой, кто получает карту, должен быть старше 16 лет (независимо от того, присутствует ли родитель или опекун). Резервные карты ограничены одной на человека и выдаются в порядке очереди. Резервные карты не гарантируют вход.
К началу страницы
Вы можете зарезервировать бесплатные билеты на запись шоу Эмбер Раффин на сайте 1iota.ком.
Мы публикуем даты шоу и заявки на билеты по мере их поступления. Пожалуйста, проверяйте 1iota, чтобы быть в курсе о шоу и наличии билетов. Запросы не могут быть отправлены на даты, которые не опубликованы в календаре.
Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Подтверждением вакцинации должен быть действительный и одобренный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства вакцинации, не будут допущены .
На момент записи вам должно быть не менее шестнадцати (16) лет для участия. На шоу не допускаются лица моложе 16 лет, независимо от того, присутствует ли родитель или опекун. Все участники вашей подтвержденной группы должны предъявить действительное удостоверение личности с фотографией. с датой рождения по прибытии и подтверждением вакцинации.
Вам нужно будет зарегистрироваться на 1iota, чтобы подать заявку на билеты на шоу Эмбер Раффин. Мы рекомендуем вам сделать это до выпуска билетов, нажав здесь: Регистрация участника 1iota. Когда вы подаете заявку на билеты на шоу Эмбер Раффин, вы автоматически попадаете в список ожидания. На данный момент у вас нет билета. Если мы сможем выполнить ваш запрос на билет, с вами свяжутся через 1iota.Если вы не получили уведомление от 1iota, мы, к сожалению, не смогли выполнить ваш запрос на билеты, и у вас нет билетов.
Все билеты бесплатны и не могут быть проданы или проданы с аукциона. Шоу Эмбер Раффин и NBCUniversal Media LLC оставляют за собой право АННУЛИРОВАТЬ любой билет, который считается купленным или проданным. Любой билет может быть АННУЛИРОВАН в любое время по усмотрению персонала шоу.
Резервные карты
Резервные карты теперь доступны каждое утро с 9:00 до 11:00 по восточному поясному времени на стенде Greeter Stand, расположенном в центре вестибюля 30 Rockefeller Plaza (через улицы 49th и 50th St. входы) прямо перед Большой лестницей. После 11:00 по восточному стандартному времени резервные карты будут доступны в магазине NBC Studios, также расположенном по адресу: 30 Rockefeller Plaza (через вход на 6-й авеню между 49-й и 50-й улицами) до 12:00. После получения пронумерованной резервной карты вам будет предложено вернуться в определенное время в день шоу, чтобы зарегистрироваться и посмотреть, сможем ли мы принять вас для записи на этой неделе. Резервные карты раздаются в течение каждой недели шоу примерно до 1 часа до начала записи.
Для получения дополнительной информации о The Shop и его часах работы посетите веб-сайт The Shop at NBC Studios.
Все гости должны быть полностью вакцинированы в день посещения и должны соблюдать все применимые протоколы COVID-19. Обратите внимание, что «полностью привитые» означают не менее четырнадцати (14) дней после получения второй дозы вакцин Pfizer/BioNtech, Moderna, AstraZeneca или Sinovac или однократной дозы вакцины Johnson & Johnson (Janssen). Доказательством вакцинации должен быть действительный и утвержденный цифровой пропуск или ваша физическая карта вакцинации, в которой указана вакцина, одобренная FDA/CDC или ВОЗ (Moderna, Pfizer/Biontech, AstraZeneca, Sinovac или Janssen/Johnson & Johnson). Это потребуется по прибытии. Гости, не предоставившие доказательства наличия вакцины, не допускаются.
Количество мест ограничено! Любой, кто получает карту, должен быть старше 16 лет (независимо от того, присутствует ли родитель или опекун). Резервные карты ограничены одной (1) на человека и выдаются в порядке очереди. Резервные карты не гарантируют вход.
К началу страницы
Не упустите шанс увидеть Голос в прямом эфире! Подпишитесь на бесплатные билеты, НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ БИЛЕТЫ НА ГОЛОС.
Верх страницы
Связанная с эндоциклом гипертрофия клеток канальцев и пролиферация клеток-предшественников восстанавливают функцию почек после острого повреждения почек
Мыши Pax8/Confetti и мыши Pax2/Confetti
(Pax8/Confetti) или Pax2. Мыши rtTA;TetO.Cre;R26.Confetti (Pax2/Confetti) были получены на полном фоне C57BL/6 путем скрещивания штамма Confetti Gt(ROSA)26Sor tm1(CAG-Brainbow2.1)Cle /J со штаммом TetO.Cre B6.Cg-Tg(TetO-Cre)1Jaw/J , оба приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США). Двойных трансгенных мышей затем скрещивали с мышами Pax8.rtTA ( B6.Cg-Tg(Pax8-rtTA2S*M2)1Koes/J , Jackson Laboratory) или с Pax2.rtTA мышь 14 для получения модели тройной трансгенной индуцируемой мыши. Мышей генотипировали, и в этом исследовании использовали только тройных гемизиготных мышей.
Рекомбинацию трансгена-репортера индуцировали в возрасте 5 недель введением 2 мг/мл или 0,25 мг/мл доксициклина гиклата (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) для мышей Pax8/Confetti и 2 мг/мл доксициклина hyclate для мышей Pax2/Confetti в питьевой воде с добавлением 2,5% сахарозы (Sigma-Aldrich) в течение 10 дней. Введение доксициклина вызывает постоянную рекомбинацию гена, кодирующего один цвет (красный, желтый, зеленый или синий флуоресцентные белки, RFP, YFP, GFP и CFP), при этом клетки GFP встречаются с меньшей частотой, чем другие цвета 12 . Дальнейший результат рекомбинации также может привести к отсутствию мечения флуоресцентного репортера в Cre-экспрессирующих клетках. После индукции мышей выдерживали в периоде вымывания в течение 1 недели, а затем умерщвляли (день 0, T0, n = 5 для мышей Pax8/Confetti, индуцированных 2 мг/мл доксициклина гиклата, n = 5 для Pax8 Мышей /Confetti индуцировали 0,25 мг/мл доксициклина гиклата и n = 4 для мышей Pax2/Confetti), в то время как другую группу содержали в вымывании еще 30 дней (T30), а затем мышей умерщвляли ( n = 5 для Мыши Pax2/Confetti, n = 4 мыши Pax8/Confetti, индуцированные 0.25 мг/мл доксициклина гиклата). Дополнительную группу индуцировали доксициклином в течение 10 дней и поддерживали в течение дополнительных 37 дней при непрерывной индукции (доксициклин Т30) (мыши Pax2/Confetti n = 4). Другую группу мышей Pax2/Confetti ( n = 3) индуцировали в возрасте 12 недель в течение 10 дней, затем содержали в периоде вымывания в течение 1 недели, а затем умерщвляли.
Во всех этих группах число самцов и самок мышей было распределено поровну. Другой экспериментальной группе после периода индукции и вымывания была проведена односторонняя ИРИ 30 минут или внутримышечная инъекция гипертонического глицерина, после чего умерщвление на 30-й день ( n = 16 для Pax8/Confetti, n = 11 для Pax2/Конфетти).Мыши с ложной операцией ( n = 5 мышей Pax2/Confetti, n = 4 мышей Pax8/Confetti) подверглись той же хирургической процедуре, что и ишемизированные мыши, но у них не было пережатия левой почечной артерии и не было ишемии.
Дополнительную группу мышей Pax2/Confetti индуцировали доксициклином в течение 10 дней, а после периода вымывания мышей подвергали односторонней ИРИ 30’. Через 24 часа после травмы мышам вводили HDACi, трихостатин (TSA, Sigma-Aldrich) 0,5 мг/кг/день в 40 мкл ДМСО в течение 3 недель i.п. ( n = 4) или 4-фенилбутират (4-PBA, Sigma-Aldrich) 1 г/кг/день в течение 3 недель с питьевой водой ( n = 4). В контрольной группе ( n = 4) мышей лечили ДМСО в течение 3 недель. Мышей забивали на 30-й день. Животных с идентичным генотипом и сходным возрастом слепым методом распределяли в экспериментальные группы.
Для проверки наличия в трансгенной системе какого-либо типа утечки или неспецифической экспрессии трансгена мышей Pax8/Confetti и Pax2/Confetti без индукции умерщвляли в Т0 и на 30-й день после IRI ( n = 3 для каждой трансгенной мыши в каждый момент времени).
Все животные были умерщвлены CO 2 Камера, почки были собраны, инкубированы в 4% параформальдегиде (PFA, Sigma-Aldrich) в PBS (Sigma-Aldrich) в течение 2 ч при 4°C с последующим погружением в 15% растворе сахарозы в PBS в течение 2 ч при 4°C, а затем в 30% растворе сахарозы в PBS в течение ночи при 4°C, затем замораживают.
Мыши Pax8/FUCCI2 и мыши Pax2/FUCCI2
Для визуализации хода клеточного цикла клеток Pax2+ и Pax8+ Pax2.rtTA;TetO.Cre;R26.Использовали мышиные модели FUCCI2 (Pax2/FUCCI2) или Pax8. rtTA;TetO.Cre;R26.FUCCI2 (Pax8/FUCCI2). Для создания двух линий мы скрестили мышей Pax2.rtTA;TetO.Cre или Pax8.rtTA;TetO.Cre с R26R-mCherry-hCdt1(30/120) (CDB0229K) и R26R-mVenus. мыши -hGem(1/110) (CDB0230K) (обе получены из CDB Laboratory for Animal Resources and Genetic Engineering, RIKEN Kobe, Japan, http://www.cdb.riken.jp/arg/reporter_mice.html), которые вместе составляют систему FUCCI2.Таким образом, мы получили четверных трансгенных мышей на полном фоне C57BL/6, которые были генотипированы, как указано в параграфе «Генотипирование».
У полученных мышей после введения доксициклина промотор Pax2 или Pax8 управляет экспрессией флуоресцентного белка mCherry-hCdt1 (30/120) (красный) в ядрах клеток в фазе G1 и флуоресцентного белка mVenus-hGem ( 1/110) (зеленый) в ядрах клеток в фазе S/G2/M. Клетки также могут выглядеть желтыми на границе G1/S, но это очень короткое событие, поэтому желтые клетки встречаются редко.Чтобы вызвать репортерную экспрессию, самцов мышей в возрасте 5 недель обрабатывали 2 мг/мл доксициклина в 2,5% растворе сахарозы в воде ad libidum, затем выдерживали в периоде вымывания в течение 1 недели (T0, Pax2/FUCCI2 n = 4 , Pax8/FUCCI2 n = 4). Процент индукции определяли у здоровых мышей как количество клеток, положительных по линии Pax8, экспрессирующих mCherry или mVenus, по отношению к общему количеству клеток канальцев на поле. После периода вымывания мышей подвергали одностороннему ИРИ продолжительностью 30 мин (та же процедура, что и у мышей Конфетти), а затем умерщвляли на 2-й день (Pax2/FUCCI2 n = 8, Pax8/FUCCI2 n = 8) и в день 30 (Pax2/FUCCI2 n = 9, Pax8/FUCCI2 n = 12).Животных с идентичным генотипом и близким возрастом распределяли в экспериментальные группы слепым методом. Чтобы проверить, проявляет ли трансгенная система какой-либо тип утечки или неспецифическую экспрессию трансгена, мышей Pax8/FUCCI2 и Pax2/FUCCI2 без индукции убивали в Т0 и на 30-й день после IRI ( n = 3 для каждой трансгенной мыши при каждом момент времени).
Всех животных умерщвляли в камере CO 2 , почки собирали и оценивали с помощью конфокальной микроскопии или проточной цитометрии. Для проведения конфокального анализа почки обрабатывали, как описано для мышей Confetti.
Мыши Pax8/FUCCI2aR и мыши Pax2/FUCCI2aR
FUCCI2aR представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с моделью FUCCI, поскольку он производит изостехиометрические количества обоих зондов FUCCI без наличия «темной фазы» в конце каждой клетки. цикл. Эта более новая модель имеет то преимущество, что оба зонда всегда экспрессируются в одном и том же соотношении, что упрощает обнаружение зелено-красного перехода и позволяет напрямую отслеживать и количественно определять количество меченых клеток с помощью проточной цитометрии с использованием программного обеспечения MACSQuant (Miltenyi Biotec S. .r.l., Болонья, Италия). По этой причине мы скрестили Pax8.rtTA;TetO.Cre ; а также Pax2.rtTA;TetO.Cre ; мышей с мышами, содержащими Cre-зависимый репортер на основе флуоресцентного убиквитина (FUCCI2aR) (European Mouse Mutant Archive (EMMA), INFRAFRONTIER-I3, Neuherberg-München, Germany), который состоит из бицистронного Cre-активируемого репортера из двух флуоресцентные белки, экспрессия которых меняется в зависимости от фазы клеточного цикла: mCherry-hCdt1 (30/120) (красный), экспрессируется в ядрах клеток в фазе G1, и mVenus-hGem (1/110) (зеленый), экспрессируется в ядрах клеток в С/Г2/М. Таким образом, мы получили тройных трансгенных мышей на полном фоне C57BL/6, которые были генотипированы, как указано в параграфе «Генотипирование».
У полученных мышей после введения доксициклина промотор Pax2 или Pax8 управляет экспрессией флуоресцентного белка mCherry-hCdt1 (30/120) (красный) в ядрах клеток в фазе G1 и флуоресцентного белка mVenus-hGem ( 1/110) (зеленый) в ядрах клеток в фазе S/G2/M. Клетки также могут выглядеть желтыми на границе G1/S, но это очень короткое событие, поэтому желтые клетки встречаются редко.
Чтобы вызвать репортерную экспрессию, самцов мышей в возрасте 5 недель обрабатывали 2 мг/мл доксициклина в 2,5% сахарозной воде ad libidum, затем выдерживали в периоде вымывания в течение 1 недели (T0, Pax2/FUCCI2aR n = 4, Pax8/FUCCI2aR n = 4). Процент индукции определяли у здоровых мышей как количество клеток, положительных по линии Pax8, экспрессирующих mCherry или mVenus, по отношению к общему количеству клеток канальцев на поле. После периода вымывания мышей-самцов подвергали одностороннему ИРИ в течение 30 мин (та же процедура, что и у мышей Конфетти), а затем умерщвляли на 2-й день (Pax2/FUCCI2aR n = 4, Pax8/FUCCI2aR n = 4) и в день 30 (Pax2/FUCCI2aR n = 9, Pax8/FUCCI2aR n = 9).Животных с идентичным генотипом и близким возрастом распределяли в экспериментальные группы слепым методом. Чтобы проверить, проявляет ли трансгенная система какой-либо тип утечки или неспецифическую экспрессию трансгена, мышей Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR без индукции умерщвляли в Т0 и на 30-й день после IRI ( n = 3 для каждой трансгенной мыши при каждом момент времени).
Всех животных умерщвляли в камере CO 2 , почки собирали и оценивали с помощью конфокальной микроскопии или проточной цитометрии.Для проведения конфокального анализа почки обрабатывали, как описано для мышей Confetti.
Генотипирование
Биоптаты хвоста инкубировали в течение ночи при 55 °C в лизирующем реагенте (1M Tris-HCl, pH 8,5; 0,5M EDTA, 20% SDS, 4M NaCl, 0,1 мг/мл протеиназы K, нейтрализованной 40 мM Tris -HCl, все от Sigma-Aldrich), центрифугируют и экстрагируют ДНК с использованием изопропанола (Sigma-Aldrich). Чтобы отличить гомозиготность трансгена от гетерозиготности, проводили qRT-PCR с использованием 5 нг/мкл геномной ДНК с помощью LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Роткройц, Швейцария).Реакции проводили с использованием LightCycler® 480 (Roche Diagnostics) с программой, состоящей из 40 циклов, каждый из которых состоял из фазы инициирования при 95°С в течение 15 мин, фазы отжига при 60°С в течение 45 мин и фазы амплификации при 72°С. на 60 мин. Использовали следующие праймеры:
Pax2.rtTA и Pax8.rtTA прямой 5′-AACGCACTGTACGCTCTGTC-3′ и обратный 5′-GAATCGGTGGTAGGTGTCTC-3′; TetO.Cre прямой 5′-TCGCTGCATTACCGGTCGATGC-3′ и обратный 5′-CCATGAGTGAACGAACCTGGTCG-3′. Геномную ДНК TCRα использовали в качестве домашнего хозяйства для относительного количественного определения и амплифицировали с использованием прямого 5′-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3′ и обратного 5′-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3′ праймеров.
Чтобы отличить гомозиготность FUCCI2aR и Confetti от гетерозиготности, ПЦР проводили со следующими праймерами и параметрами: Confetti прямой 5′-GAATTAATTCCGGTATAACTTCG-3′ и обратный 5′-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3′, 3 мин 94 °C, 35 циклов из 30 с 94 °С, 30 с 58 °С, 30 с 72 °С и, наконец, 2 мин 72 °С; FUCCI-P3 5′-TCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTC-3′, FUCCI-P4 5′-AACCCCAGATGACTACCTATCCTCC-3′ и FUCCI-P4 5′-GGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC-3′; 2 мин 96 °C, 35 циклов 96 °C 30 с, 65 °C 30 с и, наконец, 72 °C в течение 30 с.
Реперфузионное повреждение при ишемии почек
Самцов мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (100 мг/кг)/ксилазина (10 мг/кг, Bio98 S.r.L, Милан, Италия), что вызывало кратковременную хирургическую анестезию с хорошим обезболиванием. Животных до операции содержали в тепле в вентилируемой термокамере с температурой 37 °С, а температуру их тела постоянно контролировали ректальным датчиком и поддерживали в диапазоне 36,5–37 °С. Мышь была помещена на термостатическую станцию в положении на правом боку, выбрита и продезинфицирована повидон-йодом с разрезом 1-1.Выполняли 5 см кожи с левой стороны, затем рассекали и вскрывали нижележащий мышечный слой. Затем левую почку выталкивали наружу, выталкивая ее из разреза стерильными ватными тампонами, чтобы обнажить почечную ножку для пережатия. Почечная артерия была пережата, чтобы заблокировать приток крови к почке и вызвать ишемию (заметную по изменению цвета почки с красного на темно-фиолетовый). Длительность ишемии почки начинается с момента пережатия. После проверки изменения окраски почку возвращали в брюшную полость, а животное возвращали в вентилируемую нагревательную камеру.Длительность ишемии составила 30 мин, после чего зажим сняли для начала реперфузии, о чем свидетельствует изменение цвета почки обратно на красный. Мышечный слой ушивали с последующим закрытием кожной раны металлическими скобами. Сразу после закрытия раны каждой мыши вводили подкожно 0,5 мл теплого стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl) для регидратации. Правая контралатеральная почка оставалась нетронутой в качестве контроля.
Мышам с плацебо-операцией была проведена та же хирургическая процедура, что и выше, но у них не было пережатия левой почечной артерии и ишемии.
Нефротоксическое ОПП
Трансгенных самок мышей индуцировали в течение 10 дней доксициклином, выдерживали 1 неделю в режиме вымывания, после чего проводили индуцированную рабдомиолизом ОПП путем внутримышечной инъекции в день 0 гипертонического глицерина (8 мл/кг массы тела 50% раствор глицерина; Sigma-Aldrich) в нижние задние конечности.
Чрескожное измерение скорости клубочковой фильтрации
Измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) проводилось, как описано в другом месте 42 .Вкратце, мыши ( n = 9 ишемизированных мышей Pax2/Confetti, n = 13 ишемизированных мышей Pax8/Confetti, n = 5 мышей Pax8/Confetti с ложной операцией, netti-5 Pax=2/Confetti . оперированные мыши, n = 5 здоровых мышей Pax8/Confetti, n = 5 здоровых мышей Pax2/Confetti, n = 7 мышей Pax8/Confetti, получавших глицерин, n 8 мышей, получавших глицерин Pax2= , n = 7 ишемических мышей Pax2/Confetti, обработанных ДМСО, n = 6 обработанных PBS, n = 7 обработанных TSA, n = 6 обработанных PBA, где) Устройство, состоящее из двух светодиодов, фотодиода и батареи (Mannheim Pharma and Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия), крепили с помощью двусторонней клейкой ленты на шею выбритых животных.На время записи (~1,5 часа) каждое животное находилось в сознании и содержалось в одной клетке. Перед внутривенным введением 150 мг/кг ФИТЦ-синистрина (Mannheim Pharma and Diagnostics GmbH) фоновый сигнал кожи регистрировали в течение 5 мин. После удаления устройства визуализации данные были проанализированы с использованием программного обеспечения MPD Studio версии RC6 (MediBeacon GmbH Cubex41, Мангейм, Германия) 43 . СКФ [мкл/мин] рассчитывали по снижению интенсивности флуоресценции с течением времени (т. е. по периоду полувыведения FITC-синистрина из плазмы) с использованием двухкамерной модели, массы тела животных и эмпирического коэффициента пересчета.Для каждой временной точки значение СКФ нормализовали по исходному значению и по ложному (для мышей с ишемией) или по значению здоровых мышей сопоставимого возраста и веса (для мышей, получавших глицерин). На основании результатов, полученных в предварительных экспериментах по оценке вариабельности измерения СКФ, в исследование были включены только мыши, показавшие снижение СКФ после ОПП не менее чем на 20% по сравнению с исходным уровнем.
Оценка азота мочевины крови
Функцию почек оценивали путем сбора небольшого количества крови у мышей ( n = 5 ишемизированных мышей Pax8/Confetti, n = 5 мышей Pax8/Confetti, ложно оперированных, 0 n = 6 мышей Pax8/Confetti, обработанных глицерином, n = 5 здоровых мышей Pax8/Confetti, n = 8 мышей Pax2/Confetti, обработанных глицерином, n = 5 здоровых мышей Pax2/Confetti) с металлическим ланцетом поднижнечелюстного сплетения в разные моменты времени для измерения уровня мочевины мочевины.Параметры крови измеряли в образцах плазмы с антикоагулянтом ЭДТА с использованием набора Urea FS (DiaSys Diagnostic Systems, Holzheim, Germany) в соответствии с протоколами производителя.
Оценка повреждения почек
Здоровые и ишемизированные почки, хранившиеся в 4% забуференном формалине, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 2–4 мкм для периодического окрашивания кислотой–Шиффом (PAS). Ишемическое повреждение канальцев и рубцевание оценивали путем оценки процента канальцев во внешней полосе наружного мозгового вещества, в которых наблюдался клеточный некроз, дилатация канальцев или образование слепков (травма), атубулярных отделов с обильными неорганизованными клетками паренхимы и клеточными инфильтратами (рубцевание). Анализировали 24 почки мышей Pax2/Confetti и 4 поля (20×) на почку. Все оценки проводились слепым наблюдателем.
Иммунофлуоресцентная и конфокальная микроскопия
Конфокальная микроскопия выполнялась на срезах тканей почек толщиной 10 мкм с использованием конфокального микроскопа Leica SP5 AOBS (Leica, Wetzlar, Germany), оснащенного двухфотонным лазером Chameleon Ultra-II (Coherent, Milan, Италия).
Использовали следующие антитела: анти-аквапорин-1 (AQP1, AB2219, разведение 1:100, Millipore, Darmstadt, Germany), анти-Tamm-Horsfall (THP, CL1032A, разведение 1:20, Cederlane, Burlington, Ontario) , Канада), анти-аквапорин-2 (AQP2, C-17, SC-9882, разведение 1:25, Santa Cruz Biotechnology, Сент-Луис, США), антимегалин (P-20, sc-16478, разведение 1: 25, Santa Cruz Biotechnology), биотинилированный лектин лотоса, LTA (B-1325, разведение 1:50, Vector Laboratories, Burlingame, USA), анти-KIM-1 (AF1817, разведение 1:40, R&D Systems, Inc., Миннеаполис, США), анти-Pax2 (71–6000, разведение 1:25, Zymed, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) анти-Ki-67 (ab15580, разведение 1:50, Abcam, Кембридж, Великобритания), анти- GFP-488 (A21311, разведение 1:100, Life Technologies, Монца, Италия), антифосфорилированный гистон 3 (p-h4, ab14955, разведение 1:2000, Abcam), антициклинзависимая киназа 4 (CDK4, SC- 601, разведение 1:50, Santa Cruz Biotechnology) и фаллоидин-633 (A22284, разведение 1:40, Life Technologies). Вторичные антитела Alexa-Fluor были получены от Molecular Probes (Life Technologies).Для выявления канальцев проводили окрашивание фаллоидином Alexa Fluor 546 (A22283, разведение 1:40, Molecular Probes, Life Technologies). Для мышей Pax8/Confetti и для мышей Pax2/Confetti приобретение было установлено в голубых, зеленых, желтых и красных длинах волн с использованием возбуждения с длинами волн 405, 488, 514 и 543 нм соответственно. Для мышей Pax8/FUCCI2, мышей Pax2/FUCCI2, Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR сбор данных осуществляли в зеленой и красной длинах волн с использованием возбуждения 488 и 543 нм соответственно.Эмиссия mCherry собиралась через 570/620 нм BP. Ядра контрастировали DAPI (62248, разведение 1:1000, Life Technologies) с возбуждением двухфотонным лазером Chameleon Ultra-II на длине волны 800 нм.
Площадь клеточной поверхности не менее 20 клеток mCherry+p-h4− и 20 клеток mCherry+p-h4+ для каждой мыши Pax8/FUCCI2aR измеряли с помощью программного обеспечения Image J. Одно поле: 620 × 620 мкм.
Трехмерная реконструкция
Для создания трехмерных изображений (рис. 4g–i) и дополнительного фильма 1 использовалось программное обеспечение для обработки изображений Leica Microsystems «Leica Application Suite X».Стопки Z-серии были получены из срезов почек толщиной 40 мкм, поскольку эта толщина является пределом для окрашивания всех ядер с помощью DAPI, что позволяет проводить подсчет клеток. Изображения собирались с интервалом в 1 мкм. Клоны наблюдались в каждом цвете, но для 3D-реконструкции мы выбрали в основном желтые, потому что YFP распределяется по всей ячейке, что упрощает построение и оценку 3D-реконструкции.
Для сравнения 2D- и 3D-анализа два слепых наблюдателя подсчитали количество клонов в 2D-изображениях и в 3D-реконструкции.Процент клоногенных клеток рассчитывали, как указано ниже (уравнение 2).
Иммуногистохимия
Иммуногистохимия для PCNA была проведена на залитых парафином срезах здоровых и ишемизированных почек ( n = 5 на 0-й день, n = 5 на 2-й и 30-й день после IRI), как подробно описано в другом месте 4 . Вкратце, после удаления парафина и регидратации в воде срезы ткани погружали в 3% H 2 O 2 на 10 мин для блокирования активности эндогенной пероксидазы.Целевой антиген извлекали путем обработки срезов в микроволновой печи в цитратно-натриевом буфере (10 мМ, pH 6). Образцы нагревали в микроволновой печи при 800 Вт в течение 3 мин, а затем в течение 7 мин при 400 Вт. Срезы охлаждали в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого повторяли 10-минутную процедуру нагревания со свежим буфером. Срезы предварительно инкубировали в течение 30 мин в 1× PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% сапонина, а затем инкубировали в течение 15 мин при 37°С и в течение ночи при 4°С с мышиным анти-PCNA (PC10, ab29, разведение 1). :300, Абкам).Затем срезы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными биотинилированными антителами против IgG мыши, после чего инкубировали с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (набор Vectatain ABC, Vector Laboratories) в течение 30 минут и 3-амино-9- этилкарбазол (AEC, Vector Laboratories) (красный цвет) в качестве субстрата пероксидазы в течение 20 мин.
Срезы контрастировали эозином G (Bioptica, Милан, Италия).
Анализ частоты клонирования
Одноклеточные клоны и клоны с двумя или более клетками подсчитывали в канальцах AQP2- внешней полоски наружного мозгового вещества у мышей Pax8/Confetti в день 0 (T0), в контрольной группе того же возраста (T30 ), при ложной операции, при ишемии почек (IRI T30) и при нефротоксических почках (Gly T30).{\ circ} \, {\ mathrm {из}} \, {\ mathrm {клоны}}) \ раз 100, $ $
(1)
, где 1 ≤ n ≤ 11 у мышей Pax8/Confetti, поскольку это максимальный наблюдаемый размер клона.
Те же расчеты были выполнены на мышах Pax2/Confetti при T0, T30, ложнооперированных и IRI T30, где 2 ≤ n ≤ 10 (рис. 3f)
внешний мозговой мозг, взятый по меньшей мере из пяти срезов каждой мыши, подсчитывали два независимых слепых наблюдателя.{11} {\ left( {\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составленные}} \, {\ mathrm {из}} \, {{n}} \, {\ mathrm {ячейки}} \ , {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {IRI}} \, {\ mathrm {T30}}} — {{\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составлен}} \, {\ mathrm {of}}\,{{n}}\,{\mathrm{ячейки}}\,{\mathrm{at}}\,{\mathrm{T0}}} \right)},$$
, где 2 ≤ n ≤ 11 у мышей Pax8/Confetti, поскольку максимальный наблюдаемый размер клона составляет 11 клеток. {+}} {\ mathrm {cells}} \, {\ mathrm {в}} \, {\ mathrm {T0}} \ справа) \ раз 100.$$
(2)
Те же расчеты были выполнены на мышах Pax2/Confetti, где 2 ≤ n ≤ 10 (рис. 3j).
Те же расчеты были выполнены на мышах Pax8 и Pax2 Confetti через 30 дней после нефротоксического ОПП (Gly T30, рис. 1l, рис. 3n).
Те же расчеты были выполнены для 3D-анализа у мышей Pax8 и Pax2 Confetti при IRI T30 (рис. 4f)
Весь анализ был выполнен в канальцевых клетках, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества.{11} [\ влево ({\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составленные}} \, {\ mathrm {из}} \, {{n}} \, {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {IRI}} \, {\ mathrm {T30}} — {\ mathrm {клоны}} \, {\ mathrm {составлен}} \, {\ mathrm {из} } \, {{n}} \, {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {T0}} \right) \ times {{n}}], $ $
, где 2 ≤ n ≤ 11 у мышей Pax8/Confetti, поскольку максимальный наблюдаемый размер клона составляет 11 клеток.
(D) n ° новых клеток Pax8+ при IRI T30 = n ° клеток Pax8+, включенных в новые клоны– n ° клеток, давших начало новым клонам*
* n° 1 из 95 клеток что возникли новые клоны, совпадает с n ° новых клонов при ИРИ Т30 (А), поскольку каждый клон является потомством одной клетки.{+} {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm T0}) \ раз 100. $ $
(3)
Те же расчеты были выполнены для мышей Pax8/Confetti после нефротоксического ОПП (рис. 1k) и для мышей Pax2/Confetti на 30-й день после IRI (рис. 3g). У мышей Pax2/Confetti 2 ≤ n ≤ 10.
Весь анализ проводили в канальцевых клетках, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества. Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.{+} {\mathrm{ячейки}}\,{\mathrm{at}}\,{\mathrm{T}}0} \right) \times 100} \right].$$
(4)
Те же расчеты были выполнены для мышей Pax8/Confetti после ишемического ОПП (рис. 3i) и для мышей Pax2/Confetti и Pax8/Confetti после нефротоксического ОПП (рис. 3m).
Весь анализ был проведен в канальцевых клетках, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества. Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.{+} {\mathrm {ячейки}}\,{\mathrm {at}}\,{\mathrm {T}}0} \right) \times 100} \right] — 100.$$
(5)
Те же расчеты были выполнены для мышей Pax8/Confetti после ишемического ОПП (рис. 3k) и для мышей Pax2/Confetti и Pax8/Confetti после нефротоксического ОПП (рис. 3o).
Все анализы проводились на клетках канальцев, за исключением собирательных трубочек (иммуноокрашенных на AQP2) внешней полоски наружного мозгового вещества. Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.{+} {\ mathrm {ячейки}} \, {\ mathrm {at}} \, {\ mathrm {IRI}} \, {\ mathrm {T30}}} \right) \ times 100} \right].$ $
(6)
Те же расчеты были выполнены для клеток Pax2- (рис. 5e). Все подсчеты проводились двумя независимыми слепыми наблюдателями.
Частота клонов Pax2+
Этот анализ проводили в коре головного мозга после иммуноокрашивания мегалином, в OSOM после иммуноокрашивания AQP1 и THP и в собирательных трубочках после иммуноокрашивания AQP2.{+} {\mathrm {клоны}}\end{массив}.$$
n ° новых клонов определяли на основе расчета, использованного в формуле A.
(G) частота клонов Pax2+ (% ) в каждом сегменте нефрона и в собирательных трубочках=
$$\left( {A/F} \right) \times 100.$$
(7)
Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии
Анализ клеточного цикла проводили на всех клетках FUCCI2 и на всех клетках FUCCI2aR (клетки mCherry+ и mVenus+) у мышей Pax8/FUCCI2, у мышей Pax2/FUCCI2, у мышей Pax8/FUCCI2aR и у мышей Pax8/FUCCI2aR Мыши Pax2/FUCCI2aR через 2 дня и через 30 дней после ИРИ.
Почки Pax8/FUCCI2, Pax8/FUCCI2aR, Pax2/FUCCI2 и Pax2/FUCCI2aR обрабатывали для получения суспензии отдельных клеток и проведения анализа клеточного цикла с помощью проточной цитометрии. Для этого почки измельчали скальпелем. После добавления 1,5 мл буфера для расщепления (300 ЕД/мл коллагеназы II и 1 мг/мл проназы Е, Sigma-Aldrich) их инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Раствор пипетировали вверх и вниз срезанным наконечником пипетки на 1000 мкл каждые 5 мин. Расщепленные почки осторожно продавливали через градуированное сито (150 меш, Sigma-Aldrich) и поток тщательно промывали HBSS (Life Technologies).После центрифугирования супернатанты удаляли, а осадки снова переваривали буфером для расщепления при 37°С в течение 20 мин. В течение этого инкубационного периода суспензии разрезали иглой 27-G. Эритроциты лизировали 0,8% Nh5Cl. Суспензии одиночных клеток фиксировали 1% PFA в течение 1 ч при комнатной температуре и 70% этанолом в течение ночи. Затем клетки окрашивали, как описано в другом месте 45 . После инкубации с анти-DsRed pAb (632496, разведение 1:25, Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния, США) или изотипическим контролем следовала инкубация с козьим антикроличьим антителом Alexa Fluor 647 в качестве вторичного антитела для обнаружения клеток mCherry+, тогда как для обнаружения клеток mCherry+ Клетки mVenus+ использовали pAb против GFP-488 (A21311, разведение 1:100, Life Technologies).
Затем клетки инкубировали с DAPI для проведения анализа содержания ДНК. Чтобы проверить, были ли получены аналогичные результаты после истощения клеток AQP2+, почки мышей Pax8/FUCCI2 ( n = 3) обрабатывали, как указано выше, и клетки фиксировали 1% PFA в течение 1 часа при комнатной температуре. Аликвоту клеток инкубировали с pAb против AQP2 (bs-4611R, разведение 1:20, Bioss Inc., Woburn, Massachusetts) или с изотипическим контролем и с козьим антикроличьим антителом Alexa Fluor 647 в качестве вторичного антитела (Life Technologies).Оставшуюся часть клеток инкубировали с pAb против AQP2 (bs-4611R, разведение 1:20, Bioss Inc.), затем с микрогранулами MicroBeads против кроликов (Miltenyi Biotec Srl), затем пропускали через колонки для МС (Miltenyi Biotec Srl) соответственно. с протоколом производителя и сбором первого протока, содержащего немеченые клетки, чтобы выполнить истощение клеток AQP2+ с помощью магнитных ячеек. Небольшую часть как истощенных, так и неистощенных клеточных фракций AQP2 окрашивали AQP2 pAb (bs-4611R, разведение 1:20, Bioss Inc.
), затем в качестве вторичного антитела использовали козье антикроличье антитело Alexa Fluor 647, а затем анализировали с помощью прибора Cytoflex S (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния) с программным обеспечением CytExpert. AQP2-истощенную клеточную фракцию фиксировали 70% этанолом в течение ночи и на следующий день окрашивали анти-DsRed pAb (632496, разведение 1:25, Clontech) и анти-GFP pAb (A21311, разведение 1:100, Life Technologies) как выше для оценки клеток mCherry+ и mVenus+. В каждом эксперименте анализировали более 50 000 событий с использованием прибора FACS LSRII (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) с программным обеспечением FACSDiva или с помощью прибора Cytoflex S (Beckman Coulter) с программным обеспечением CytExpert.В экспериментах с мышами Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR было проанализировано более 50 000 событий с использованием прибора FACS LSRII (BD Biosciences) и прибора MacsQuant (Miltenyi Biotec S.r.l.). Оценку общего количества клеток Pax8/FUCCI2aR и Pax2/FUCCI2aR проводили с использованием прибора MacsQuant (Miltenyi Biotec S.
r.l.). Вторичное антитело Alexa Fluor 647 возбуждали лазерной линией 633 нм, GFP pAb возбуждали лазерной линией 488 нм, DAPI возбуждали УФ-лазером 355 нм.
Ткани
В общей сложности 5 здоровых почек (4 мужчины и 1 женщина, средний возраст 56,2 ± 11 лет) и 10 биоптатов почек пациентов (средний возраст 43,7 ± 7,2 года), у которых развилась ХБП после ОПП, были проанализированы в соответствии с Этическим комитетом. об экспериментах на людях Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi и Детской университетской больницы Мейера, Флоренция, Италия. Нормальные фрагменты почки получали с полюса, противоположного опухоли, у больных, перенесших нефрэктомию по поводу локализованных опухолей почки.Формальные согласия были получены донорами или родственниками. Стадия ОПП была классифицирована в соответствии с рекомендациями KDIGO 46 .
Список пациентов с ХБП после ОПП, проанализированных в этом исследовании, представлен в Таблице 1. , Тарритаун, штат Нью-Йорк, США) в сочетании с Phalloidin-546 (A22283, разведение 1:40, Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.
Разрешение на исследование
Эксперименты на животных были одобрены Институциональным наблюдательным советом, Министерством здравоохранения Италии и Комитетом по этике «Regierung von Oberbayern» и проводились в соответствии с институциональными, региональными и государственными инструкциями и в соответствии с Руководство Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Мышей содержали в специальном помещении, свободном от патогенов, со свободным доступом к пище и воде и 12-часовым циклом день/ночь.
Статистический анализ
Результаты были выражены как среднее ± SEM. Сравнение между группами выполняли с помощью критерия Манна-Уитни U или посредством дисперсионного анализа для множественных сравнений (ANOVA для повторных измерений) с апостериорным анализом Тьюки. p < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступность данных
Авторы заявляют, что все данные, подтверждающие результаты этого исследования, доступны в статье и ее дополнительных информационных файлах или у соответствующего автора по обоснованному запросу.