Вк 36 студия: Telegram: Contact @studio36

Студии ДК «Богатырский, 36»

1. Студии ДК «Богатырский, 36»

Задать свои вопросы по записи в студии вы можете по телефону: 308-09-25

____________________________________________________

РАСПИСАНИЕ БЮДЖЕТНЫХ СТУДИЙ 2021/2022
РАСПИСАНИЕ ПЛАТНЫХ СТУДИЙ 2021/2022

____________________________________________________

ВОКАЛЬНО-ХОРОВОЕ НАПРАВЛЕНИЕ

	Вокальная студия «Да!Рина» для детей 7-13 лет (отбор) Руководитель: Екатерина Дмитриевна Сычугова Постановка голоса: дыхание, интонирование, фразировка Разучивание вокальных произведений Постановка номеров и концертных программ Участие в концертах, фестивалях и конкурса Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk. com/club152794149
	Вокальная студия «Малахит» для взрослых 18-45 лет и старше (с 14 лет — индивидуальное прослушивание) Руководитель: Екатерина Дмитриевна Сычугова Постановка голоса: дыхание, интонирование, фразировка Разучивание вокальных произведений Постановка концертных программ и номеров Участие в концертах, фестивалях и конкурсах Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club153048075
	Вокальная студия «Звёздочки» для детей 4-7 лет Руководитель: Игорь Александрович Перов Программа по вокальному творчеству реализуется в художественно-эстетической направленности. Занимаясь в ансамбле, дети получают не только вокальную подготовку, но и знакомятся с шедеврами современной и классической музыки, осваивают  музыкальную грамоту, приобретают навыки выступления перед зрителями, развивают умственные и физические способности. Расписание занятий На платной основе Группа ВК: vk.com/club170723834
	Студия игры на гитаре «Мелодия» для детей 7-16 лет  Руководитель: Екатерина Николаевна Егорова Предлагаемый курс игры на шестиструнной гитаре в студии «Мелодия» рассчитан на детей, подростков и молодежи, начиная с семилетнего возраста. За год предстоит освоить навыки игры нетрудных произведений из классического гитарного репертуара, подбирать несложный аккомпанемент. Занятия в студии призваны помочь в овладении основами музыкальной грамоты и игры на гитаре. Целеустремленным, настойчивым и увлеченным начинающим гитаристам программа поможет приобрести необходимые знания, уверенность в своих силах, почувствовать радость живого музицирования. Расписание занятий На платной основе Набора нет
	Вокальная студия «Вдохновение» для людей с ограниченными возможностями по зрению для взрослых от 25 лет Руководитель: Дарья Борисовна Усанова Каждый человек от природы наделен особым даром – голосом. Именно голос помогает человеку общаться с окружающим миром, выражать свое отношение к различным явлениям жизни. Люди, которые частично или полностью потеряли зрение, обладают всеми адаптивными системами: слухом, тактильными ощущениями. Занятия музыкой в студии являются прекрасным средством реабилитации, раскрепощения, оптимистического настроения, уверенности в своих силах. В студии существуют малые вокальные формы: солисты, дуэты, трио. Участники и солисты принимают участие в смотрах, конкурсах и фестивалях самодеятельного искусства. Расписание занятий На бюджетной основе Группа ВК: vk.com/club106737118

____________________________________________________

ТАНЦЕВАЛЬНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ

Студия спортивного танца «Skillz» (брейк-данс) для детей от 7 лет и подростков Руководитель: Дмитрий Сергеевич Нестеренко Спортивный танец – это возможность научиться двигаться, развить пластичность, чувство ритма, выплеснуть свою энергию и самовыразиться. Основное направление студии: BreakDance. Занятия включают в себя общую физическую подготовку, растяжки, а также акробатику и основы хореографии. Регулярно танцуя брейк, танцор чувствует, как становится более сильным, уверенным, активным человеком, реже болеет. Жизнь становится интереснее, ярче и счастливее! Расписание занятий На платной основе Группа ВК: vk.com/club166097500

____________________________________________________

РАЗВИВАЮЩЕЕ НАПРАВЛЕНИЕ

Шахматный клуб «Ладья» для детей от 4-10 лет Руководитель: Наталья Игоревна Сорокина Шахматы — это не только популярная игра, но и действенное, эффективное средство интеллектуального развития детей. Игра в шахматы способствует концентрации внимания и развивает логическое мышление, укрепляет память, развивает изобретательность. Увлечение игрой в шахматы помогает ребятам развить в себе такие качества, как память, воображение, интуиция, целеустремленность, умение находить выход из затруднений, способность к самоанализу. Наблюдения психологов подтверждают, что показатели умственного развития у школьников, изучающих игру в шахматы, через достаточно короткое время становятся выше, чем у сверстников. Расписание занятий На платной основе

____________________________________________________

ТЕАТРАЛЬНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ

Театральная студия «Маска» для детей 6-15 лет и взрослых Руководитель: Марина Олеговна Крыжко На занятиях участники знакомятся с основами актерского мастерства, сценического движения, речи, учатся импровизировать. Путем специальных тренингов, упражнений и игр происходит раскрепощение личности, снятие психологических барьеров. Участники студии приобретают навык выступления перед публикой, участвуя в различных мероприятиях Дома культуры, Городских и Всероссийских фестивалях и конкурсах. Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club60890425, vk.com/club101426218

Театральная студия «Сказка» для детей 3-6 лет Руководитель: Марина Олеговна Крыжко Занятия в детской театральной студии раскроют индивидуальность и природные способности Вашего ребёнка. В театральной деятельности дети учатся выражать свои чувства, правильно излагать мысли, взаимодействовать друг с другом и чувствовать партнёра; преодолевают боязнь публичности, пробуют себя в различных театральных жанрах. В программе студии — занятия по актёрскому мастерству. сценической речи и движению, постановка мини-спектаклей и сказок. Расписание занятий На платной основе Группа ВК: vk.com/tsskazka

____________________________________________________

ДЕКОРАТИВНО-ПРИКЛАДНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ

	Студия семейного творчества «Заинька» для детей 1,5-3 лет с родителями Руководитель: Алина Евгеньевна Матросова Программа предназначена для совместных занятий детей с родителями. Для маленьких детей такое обучение значимо, потому что во все века родители через сказки, былины, песни передавали детям историю семьи, деревни, необходимые для жизни знания и умения. В процессе занятий происходит приобщение городских детей к истокам народного творчества и возрождении русской традиционной культуры. Чем раньше ребенок начнет изучать и понимать культуру своей страны, тем понятнее и роднее ему она будет в дальнейшем. Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club31036420
	Клуб традиционной культуры «Старая деревня» Руководитель: Алина Евгеньевна Матросова Клуб традиционной культуры «Старая Деревня» работает по таким направлениям, как музыкальный фольклор и прикладное творчество. Музыкальный фольклор включает в себя народную песню и танец, народную инструментальную музыку, обряды, народный театр. Ярким явлением в традиционной культуре, безусловно, является песня. Народная песня и народная манера пения, наряду с языком – важнейшая составляющая русской этнической культуры. Основной задачей прикладного творчества стало изучение женских ремесел, таких как шитье, вышивка, ткачество с целью изучения и создания народного костюма. В рамках клуба «Старая Деревня» созданы группы по освоению различных направлений традиционной культуры. Предварительное расписание: Группа «Карусель» (дети, фольклорная студия) — вторник 17:30-19:10 Группа «Фольклорный ансамбль» (взрослые) — вторник 19:20-21:00 Группа «Прикладное творчество» (народный костюм) — среда 13:00-14:40 Группа «Семейный клуб» — пятница 17:30-19:10 Группа «Фольклорный ансамбль» (взрослые) — пятница 19:25-20:30 Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club31036420
	Кружок валяния шерсти «Свалянная сказка»  для детей от 10 лет Руководитель: Мария Владимировна Шарипова Сухое валяние (валяние иглами) — это уплотнение шерсти специальными иголками с насечками, которые подцепляют и спутывают волокна. Этот способ валяния напоминает лепку и позволяет получить объемные изделия. Валяние шерсти раскрывает творческий потенциал, улучшает координацию рук, способствует развитию фантазии и воображения, учит правильному пропорциональному восприятию. Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club94442109
	Мастерская ремёсел «Слобода» для взрослых Руководитель: Марианна Николаевна Беляева (Медведева) Расписание занятий      На бесплатной основе
	Кружок декоративно-прикладного творчества «Рукодельница»  для детей от 15 лет  Руководитель: Мария Владимировна Шарипова На занятиях студии можно освоить различные техники современного декоративно-прикладного творчества. 1 год занятий: основные техники работы с полимерной глиной, изготовление украшений. 2 год занятий: освоение следующих техник: квиллинг, декупаж, декопатч, кукла тильда, скрапбукинг и др. Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club88358417
	Студия «Умелые ручки» для детей 3-9 лет Руководитель: Зоя Владимировна Челозерцева В процессе творчества происходит самовыражение, выражение различных эмоций. При этом возникает чувство единения в общей деятельности между детьми и взрослым, чувство сопричастности, общего дела. Формируется усидчивость и ответственность, дети учатся мыслить самостоятельно, творчески. При работе с природными материалами появляется чувство единения с природой, бережное отношение к ее дарам. При работе с подручными средствами ( баночки, коробочки, пластиковые бутылки и пр. ) развивается ассоциативное мышление. Расписание занятий                                                                                                                    На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/umelyeruchkipkc
	Клуб любителей декоративно-прикладного творчества «Мир творчества» для детей 6-12 лет Руководитель: Елена Александровна Давитая Воображение и фантазия – важнейшая сторона жизни ребенка. Основной пик развития воображения и фантазии идет в возрасте от 3 до 15 лет. И очень важно не упустить возможность сделать жизнь нашего ребенка ярче, богаче и интереснее. Особенно важна связь творчества с мышлением ребенка. При этом в работу включаются зрительные, двигательные, мускульно-осязаемые анализаторы. Кроме того, занятия развивают память, внимание, мелкую моторику, учат ребенка думать и анализировать, соизмерять и сравнивать, сочинять и воображать. Расписание занятий На бесплатной основе Набора нет Группа ВК: vk.com/mir_tvorchestva_pkc

____________________________________________________

ИЗОБРАЗИТЕЛЬНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ

Студия живописи «Колорит» для взрослых (запись в резерв) Руководитель: Марина Фёдоровна Бабий В результате реализации программы предполагается достижение определенного уровня овладения изобразительной грамоты. Занимающиеся освоят специальную терминологию, получат представление о видах и жанрах искусства, научатся обращаться с основными художественными материалами и инструментами изобразительного искусства, разовьют индивидуальные особенности, смогут написать картину как для собственного интерьера, так и для подарка. Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club79297764

Изостудия«Весёлые ладошки» для детей 3-6 лет Руководитель: Мария Юрьевна Глазкова На занятиях учат рисовать от простого к сложному, от предметного рисунка к сюжетному произведению. Работая творчески, ребенок испытывает целую гамму положительных эмоций, как от процесса деятельности, так и от полученного результата. Через творческую деятельность формируется эстетическая восприимчивость ребенка к миру, оценка прекрасного. Занимающиеся в студии регулярно участвуют в различных конкурсах и фестивалях. Расписание занятий На платной основе

____________________________________________________

КУЛЬТУРНО-ПРОСВЕТИТЕЛЬСКОЕ НАПРАВЛЕНИЕ

Клуб любителей Санкт-Петербурга «Любимый город» для взрослых и старшего поколения, для детей от 7 до 12 лет Руководитель: Раиса Кузьминична Иванова Санкт-Петербург — город с великой историей и наследием, город-музей. Занятия в кружке познакомят участников с музеями и парками, интересными фактами об истории различных зданий и культурных объектов нашего города. В программе кружка: лекции, познавательные занятия, интеллектуальные игры, викторины, экскурсии по городу и окрестностям. Расписание занятий На бесплатной основе Группа ВК: vk.com/club140252929, vk.com/club140255999, vk.com/club80439365

____________________________________________________

ЛЮБИТЕЛЬСКИЕ КЛУБЫ ПО ИНТЕРЕСАМ

	Клуб любителей живописи «Радуга» для взрослых Руководитель: Любовь Афанасьевна Сухочева На добровольной основе Набора нет
	Студия спортивного танца «Ломаный танец» от 14 до 60 лет Руководитель: Дмитрий Сергеевич Нестеренко Breaking или b-boying (англ. breakdance) – уличный танец, одно из течений культуры хип- хоп, поэтому в нем нет правил и ограничений. Главное, что и сегодня в нем ценится, это умение двигаться в такт с музыкой. Его можно танцевать одному, самостоятельно устанавливая ритм, с которым «справишься», или в паре с партнером. Здесь приходится вырабатывать комбинацию движений, рассчитанных на обоих участников. Брейк выбирают по разным причинам, однако, регулярно танцуя брейк, танцор чувствует, как становится более сильным, уверенным, активным человеком, реже болеет. На добровольной основе
	Клуб ирландского танца на добровольной основе «Луназа» для молодежи от 18 лет и старше Руководитель: Яна Владимировна Космачева Занятия в клубе помогут овладеть основными средствами хореографической выразительности, привить любовь, уважение и чуткое отношение к хореографическому искусству, воспитать эстетический вкус, а также познакомят участников с историей и  танцевальной культурой Ирландии.   На добровольной основе

VK сообщила о перестановках в топ-менеджменте и новой оргструктуре

Фото: vk.com

Автор: Алексей Жданов

Компания VK объявила о назначении Александра Айвазова и Степана Ковальчука на позиции старших вице-президентов. Ирина Сиренко заняла пост вице-президента VK.

Александр Айвазов назначен старшим вице-президентом по инвестициям и развитию бизнеса, уточняется в сообщении VK. «Он будет курировать эти сферы, а также M&A и направление онлайн-образования», — отмечается в пресс-релизе.

До прихода в VK Айвазов отвечал за развитие бизнеса «Ростелекома» в должности вице-президента. Ранее он руководил компаниями, которые специализировались на прямых инвестициях в высокотехнологичные компании и консолидации активов, занимался сделками слияния и поглощения в России и за рубежом, а также стратегическим консультированием.

Старшим вице-президентом по медиастратегии и развитию сервисов назначен Степан Ковальчук, ранее занимавший должность вице-президента по развитию бизнеса VK. Ковальчук работает в VK с 2017 года. В новой должности он будет курировать стратегические для компании направления музыки и контента, а также работу с сообществами. В новое подразделение войдут соответствующие команды, в частности департамент по видеоконтенту и музыкальным сервисам во главе с вице-президентом Андреем Димитровым, а также дирекция рекомендательных систем под руководством Сергея Шалаева.

Вице-президентом по связям с государственными органами утверждена Ирина Сиренко. Ранее она работала в Минобрнауки РФ, Минцифры, Департаменте информационных технологий Москвы. До перехода в VK Сиренко была вице-президентом по взаимодействию с органами государственной власти в «Ростелекоме».

«Перед нами стоят амбициозные цели по развитию экосистемы VK, укреплению ее роли на российском рынке. Компания обладает всем необходимым для успеха: уникальными технологиями и платформой, а самое главное – командой профессионалов. Усиление команды направлено на развитие бизнеса в ключевых направлениях и укрепление партнерств. Уверен, вместе мы сможем выйти на новый уровень и повысить статус VK в качестве лидера цифровых сервисов и услуг для наших пользователей», — приводятся в сообщении слова гендиректора VK Владимира Кириенко, сменившего на этом посту Бориса Добродеева в декабре 2021 года. До назначения главой VK Кириенко занимал пост первого вице-президента «Ростелекома».

В России зафиксирован исторический рекорд по вводу жилья :: Жилье :: РБК Недвижимость

Объем жилищного строительства составил в прошлом году 92,6 млн кв. м жилья — это максимум за всю историю страны

Фото: Studio Romantic/shutterstock.com

По итогам 2021 года в России было построено 92,6 млн кв. м жилья. Это на 13% выше, чем в 2020 году, и новый максимум за всю историю, сообщил вице-премьер Марат Хуснуллин в понедельник, 7 февраля.

По данным Росстата, в 2020 году в России было введено 82,2 млн кв. м жилья. «В прошлом году мы ввели 92,6 млн кв. м жилья. Это самый большой объем ввода за всю историю, начиная с Советского Союза. Это на 13% превышает показатели 2020 года. С учетом всех ограничений мы все равно дали такой серьезный прирост», — сказал Марат Хуснуллин на совещании с премьером-министром Михаилом Мишустиным. По словам вице-премьера, рекордный объем ввода жилья позволил улучшить жилищные условия 4,2 млн семей (около 10 млн человек).

Позитивная динамика по строительству жилья наблюдается и в начале 2022 года, отметил Хуснуллин. «Мы плюсом к январю 2021 года дали 14% ввода. Это говорит о том, что сделаны достаточно серьезные заделы, которые позволяют нам, несмотря на все сложности программы, надеяться, что все показатели будут выполнены и перевыполнены», — добавил он.

Ввод жилья в России по итогам 2021 года превысил изначальные прогнозы вице-премьера. В ноябре Хуснуллин говорил, что в России планируется ввести 86 млн кв. м жилья — максимальный годовой объем для страны. По его мнению, выход на рынок нового предложения позволит в том числе бороться с ростом цен на квартиры.

Читайте также

Автор

Наталия Густова

Премьера военной драмы «Однажды в пустыне» о событиях в Пальмире состоялась в Москве — Общество

МОСКВА, 9 февраля. /ТАСС/. Премьера остросюжетной драмы «Однажды в пустыне» режиссера Андрея Кравчука, сюжет которой разворачивается в период разминирования древней сирийской Пальмиры, состоялась в столичном киноцентре «Октябрь». Создатели стремились создать кино о современных военных, которое сможет тронуть зрителей, рассказал продюсер проекта Алексей Учитель.

Премьера состоялась в главном зале киноцентра: в холле разместили мольберты с картинами исторического разминирования Пальмиры, которые предоставили инженерные войска. Перед началом показа на сцене для гостей играл духовой оркестр. «Это кино сделано замечательными людьми. Очень сложно снимать современную картину о военных, о нашей армии, и при этом избежать ложного патриотизма, снимать кино, которое эмоционально, по-человечески нас всех тронет. Мне кажется, это удалось сделать. Надеюсь, у вас оно тоже найдет отклик», — сказал Учитель, представляя картину. Он особо поблагодарил за содействие в создании фильма Минобороны РФ.

Главным героем фильма становится сапер по фамилии Шаберов. По сюжету он отправляется на разминирование захваченной боевиками Пальмиры и мечтает вновь увидеть местную девушку, которой сумел помочь. По мере приближения к древнему городу отношения внутри военного отряда усложняются, а обстановка вокруг становится все более напряженной. Сценарий картины написал Ариф Алиев. «Когда Алексей Ефимович предложил мне сделать этот проект, я прочитал сценарий и сразу в него влюбился. Я попал в уютную семейную атмосферу, полную любви и заботы, на студии «Рок», — поделился Кравчук.

Режиссер назвал «Однажды в пустыне» фильмом о дружбе, любви, преданности и долге. «Он рассказывает о непростых человеческих отношениях и о том, что место для подвига есть и в наши дни», — добавил Кравчук.

Роли в картине исполнили Александр Робак, Екатерина Нестерова, Павел Чинарев и другие. «Мы делали очень честное кино, надеюсь, что у нас это получилось», — подчеркнул Робак.

Консультант проекта от инженерных войск Николай Донюшкин отметил достоверность образа капитана Шаберова, которого военные начали воспринимать «как одного из товарищей». «Мы считаем, что его образ стоит в одном ряду с теми классическими образами, которые были созданы еще в советском кино. <…> Образ Шаберова объединил в себе все черты современного российского сапера. Именно поэтому мы будем просить актера Александра Робака позировать в Студии Грекова (Студия военных художников имени Грекова — прим. ТАСС) для создания памятника в сквере военных инженеров в парке «Патриот», — рассказал он со сцены.

Фильм создавался киностудией «Рок» при поддержке Фонда кино, телекомпании НТВ и Министерства обороны РФ. Он выходит в широкий прокат 17 февраля.

О Пальмире

Пальмира (Тадмор) — один из богатейших городов поздней античности в оазисе Сирийской пустыни между Дамаском и Евфратом. По преданию, город был основан библейским царем Соломоном. Развалины Пальмиры внесены в список объектов Всемирного наследия ЮНЕСКО. Боевики запрещенной в России террористической группировки ИГ, захватив город в мае 2015 года, разрушили несколько древнейших памятников, включая Триумфальную арку, статую Льва Аллата, храм Баалшамина и самое большое сооружение города — храм Бэла, построенный при императоре Тиберии в 32 году н. э.

Роланд — ВК-8М | Органный звуковой модуль

Душа популярного ВК-8

С момента своего появления компания Roland’s VK-8 Combo Organ произвел сильное впечатление на заядлых поклонников органа — хвалят за естественное и аутентичное звучание. Теперь Роланд делает эти Звуки виртуального органа ToneWheel доступны любому музыканту с настольный ВК-8М. Благодаря новому моделированию усилителя COSM, девяти тактам гармоник и простое управление с помощью ручек, VK-8M обеспечивает выдающееся органное звучание с простым редактированием на передней панели.Игроки также могут погрузиться в более подробные параметры звука, такие как уровень утечки и скорость вращения низкочастотного динамика.

Моделирование бортового усилителя COSM

Удивительные органные звуки VK-8M улучшены с помощью COSM Amp. Моделирование. Для создания все, от чистых евангельских органов до грубых перегруженных звуков рок-орган. Недавно разработанный усилитель COSM Amp Type IV отличается особенно из-за его убийственного усиления и хрустящего эффекта искажения. ВК-8М выводит моделирование органов на совершенно новый уровень реализма с интуитивно понятным редактирование каждого параметра.

Уникальная функция Active Expression

исполнителей по достоинству оценят линейный вход VK-8M и функцию Active Expression. Используя дополнительную педаль экспрессии EV-7, игроки могут постепенно переходить звук от внешнего источника, такого как синтезатор или модуль MIDI. Например, медленно затухая звук пэда, музыканты могут часть песни или создайте энергию, переходя в более резкий тон, например латунь. Эти особенности открывают совершенно новый уровень самовыражения.

Исключительный исполнитель

С Контроллер D Beam, VK-8M предлагает исполнителям целый мир выражение.Использование инфракрасного луча света со светодиодом, который изменяет цвет по мере того, как ваша рука меняет расстояние, игроки могут управлять такими функциями когда скорость вращения (медленно/быстро) или двигатель тонального колеса останавливаются. А с 36 ячеек памяти, вы можете сохранить пользовательские настройки простым нажатием процедуры и вызовите свои звуки с помощью выбора банка и шести Кнопки регистрации.

Коды виртуальных ключей (Winuser.h) — приложения Win32

• Статья
• 19.01.2022
• 5 минут на чтение

Полезна ли эта страница?

Пожалуйста, оцените свой опыт

да Нет

Любая дополнительная обратная связь?

Отзыв будет отправлен в Microsoft: при нажатии кнопки отправки ваш отзыв будет использован для улучшения продуктов и услуг Microsoft.Политика конфиденциальности.

Представлять на рассмотрение

В этой статье

В следующей таблице показаны имена символических констант, шестнадцатеричные значения и эквиваленты мыши или клавиатуры для кодов виртуальных клавиш, используемых системой. Коды перечислены в порядке номеров.

Константа	Значение	Описание
VK_LBUTTON	0x01	Левая кнопка мыши
ВК_РБУТТОН	0x02	Правая кнопка мыши
ВК_ОТМЕНА	0x03	Обработка прерывания управления
ВК_МБУТТОН	0x04	Средняя кнопка мыши (трехкнопочная мышь)
VK_XBUTTON1	0x05	Кнопка мыши X1
VK_XBUTTON2	0x06	Кнопка мыши X2
-	0x07	Не определено
ВК_НАЗАД	0x08	Клавиша НАЗАД
ВК_ТАБ	0x09	Клавиша TAB
-	0x0A-0B	Зарезервировано
VK_CLEAR	0x0C	Клавиша ОЧИСТКИ
ВК_ВОЗВРАТ	0x0D	Клавиша ВВОД
-	0x0E-0F	Не определено
ВК_ШИФТ	0x10	Клавиша SHIFT
VK_CONTROL	0x11	Клавиша CTRL
ВК_МЕНЮ	0x12	Клавиша ALT
ВК_ПАУЗА	0x13	Клавиша ПАУЗА
ВК_КАПИТАЛ	0x14	Клавиша CAPS LOCK
ВК_КАНА	0x15	Режим IME Кана
ВК_ХАНГЕЛЬ	0x15	Режим IME Hanguel (поддерживается для совместимости; используйте VK_HANGUL )
ВК_ХАНГУЛ	0x15	Режим хангыль IME
ВК_ИМЭ_ОН	0x16	IME на
VK_JUNJA	0x17	Режим IME Junja
ВК_ФИНАЛ	0x18	Конечный режим IME
ВК_ХАНДЖА	0x19	Режим IME Hanja
ВК_КАНДЗИ	0x19	Режим кандзи IME
ВК_ИМЕ_ОФФ	0x1A	IME выкл.
VK_ESCAPE	0x1B	Клавиша ESC
ВК_КОНВЕРТ	0x1C	Преобразование IME
ВК_НЕПРЕОБРАЗОВАТЬ	0x1D	IME без преобразования
ВК_АКСЕПТ	0x1E	IME принять
VK_MODECHANGE	0x1F	Запрос на изменение режима IME
ВК_ПРОСТРАНСТВО	0x20	ПРОБЕЛ
ВК_ПРИОР	0x21	Клавиша СТРАНИЦА ВВЕРХ
ВК_NEXT	0x22	Клавиша СТРАНИЦА ВНИЗ
ВКонтакте	0x23	Клавиша КОНЕЦ
ВКонтакте	0x24	Клавиша ДОМОЙ
ВК_ЛЕФТ	0x25	Клавиша СТРЕЛКА ВЛЕВО
ВК_УП	0x26	Клавиша со стрелкой вверх
ВК_ПРАВО	0x27	Клавиша со СТРЕЛКОЙ ВПРАВО
ВК_ВНИЗ	0x28	Клавиша со стрелкой вниз
ВК_ВЫБОР	0x29	Клавиша ВЫБОР
ВК_ПРИНТ	0x2A	Клавиша ПЕЧАТЬ
VK_EXECUTE	0x2B	Клавиша ВЫПОЛНИТЬ
ВК_СНИМОК	0x2C	Клавиша ПЕЧАТЬ ЭКРАНА
VK_INSERT	0x2D	Ключ ИНС
ВК_УДАЛИТЬ	0x2E	Клавиша ДЕЛ
ВК_ПОМОЩЬ	0x2F	Клавиша ПОМОЩИ
	0x30	0 ключ
	0x31	1 ключ
	0x32	2 ключа
	0x33	3 ключа
	0x34	4 ключа
	0x35	5 ключей
	0x36	6 ключей
	0x37	7 ключей
	0x38	8 ключей
	0x39	9 ключ
-	0x3A-40	Не определено
	0x41	Ключ А
	0x42	Ключ В
	0x43	Ключ С
	0x44	D-ключ
	0x45	Ключ Е
	0x46	F-ключ
	0x47	Ключ G
	0x48	Ключ Н
	0x49	I ключ
	0x4A	Ключ J
	0x4B	Ключ К
	0x4C	Г ключ
	0x4D	М ключ
	0x4E	Ключ N
	0x4F	О-ключ
	0x50	P-ключ
	0x51	Q-ключ
	0x52	Ключ Р
	0x53	Ключ S
	0x54	Т-образный ключ
	0x55	U-образный ключ
	0x56	V-образный ключ
	0x57	Ключ W
	0x58	Х ключ
	0x59	Ключ Y
	0x5A	Ключ Z
VK_LWIN	0x5B	Левая клавиша Windows (обычная клавиатура)
ВК_РВИН	0x5C	Правая клавиша Windows (обычная клавиатура)
VK_APPS	0x5D	Клавиша приложений (обычная клавиатура)
-	0x5E	Зарезервировано
ВК_СОН	0x5F	Клавиша режима сна компьютера
VK_NUMPAD0	0x60	Клавиша цифровой клавиатуры 0
VK_NUMPAD1	0x61	Цифровая клавиатура 1 клавиша
VK_NUMPAD2	0x62	Клавиша цифровой клавиатуры 2
VK_NUMPAD3	0x63	Клавиша цифровой клавиатуры 3
VK_NUMPAD4	0x64	Цифровая клавиатура 4 клавиши
VK_NUMPAD5	0x65	Цифровая клавиатура 5 клавиш
VK_NUMPAD6	0x66	Цифровая клавиатура 6 клавиш
VK_NUMPAD7	0x67	Цифровая клавиатура 7 клавиш
VK_NUMPAD8	0x68	Цифровая клавиатура 8 клавиш
VK_NUMPAD9	0x69	Клавиша цифровой клавиатуры 9
ВК_МУЛЬТИПЛИ	0x6A	Клавиша умножения
ВК_АДД	0x6B	Добавить ключ
ВК_СЕПАРАТОР	0x6C	Ключ-разделитель
ВК_ВЫЧИТАНИЕ	0x6D	Ключ вычитания
VK_DECIMAL	0x6E	Десятичный ключ
ВК_РАЗДЕЛ	0x6F	Клавиша разделения
ВК_Ф1	0x70	Клавиша F1
ВК_Ф2	0x71	Клавиша F2
ВК_Ф3	0x72	Клавиша F3
ВК_Ф4	0x73	Клавиша F4
ВК_Ф5	0x74	Клавиша F5
ВК_Ф6	0x75	Клавиша F6
ВК_Ф7	0x76	Клавиша F7
ВК_Ф8	0x77	Клавиша F8
ВК_Ф9	0x78	Клавиша F9
ВК_Ф10	0x79	Клавиша F10
ВК_Ф11	0x7A	Клавиша F11
ВК_Ф12	0x7B	Клавиша F12
ВК_Ф13	0x7C	Клавиша F13
ВК_Ф14	0x7D	Клавиша F14
ВК_Ф15	0x7E	Клавиша F15
ВК_Ф16	0x7F	Клавиша F16
ВК_Ф17	0x80	Клавиша F17
ВК_Ф18	0x81	Клавиша F18
ВК_Ф19	0x82	Клавиша F19
ВК_Ф20	0x83	Клавиша F20
ВК_Ф21	0x84	Клавиша F21
ВК_Ф22	0x85	Клавиша F22
ВК_Ф23	0x86	Клавиша F23
ВК_Ф24	0x87	Клавиша F24
-	0x88-8F	Не назначено
VK_NUMLOCK	0x90	Клавиша NUM LOCK
ВК_ПРОКРУТКА	0x91	Клавиша БЛОКИРОВКИ ПРОКРУТКИ
	0x92-96	Специально для OEM
-	0x97-9F	Не назначено
ВК_ЛШИФТ	0xA0	Левая клавиша SHIFT
ВК_РШИФТ	0xA1	Правая клавиша SHIFT
VK_LCONTROL	0xA2	Левая клавиша УПРАВЛЕНИЯ
VK_RCONTROL	0xA3	Правая клавиша УПРАВЛЕНИЯ
VK_LMENU	0xA4	Левая клавиша МЕНЮ
ВК_РМЕНЮ	0xA5	Правая клавиша МЕНЮ
VK_BROWSER_BACK	0xA6	Клавиша возврата в браузере
VK_BROWSER_FORWARD	0xA7	Клавиша переадресации браузера
VK_BROWSER_REFRESH	0xA8	Клавиша обновления браузера
VK_BROWSER_STOP	0xA9	Клавиша остановки браузера
VK_BROWSER_SEARCH	0xAA	Ключ поиска браузера
ВК_БРАУЗЕР_ИЗБРАННОЕ	0xАВ	Клавиша избранного браузера
VK_BROWSER_HOME	0xАС	Браузер Пуск и Клавиша Домой
VK_VOLUME_MUTE	0xAD	Клавиша отключения звука
ВК_VOLUME_DOWN	0xAE	Клавиша уменьшения громкости
ВК_VOLUME_UP	0xAF	Клавиша увеличения громкости
ВК_МЕДИА_NEXT_TRACK	0xB0	Клавиша следующей дорожки
ВК_МЕДИА_ПРЕВ_ТРЕК	0xB1	Клавиша предыдущей дорожки
ВК_МЕДИА_СТОП	0xB2	Клавиша Stop Media
ВК_МЕДИА_PLAY_PAUSE	0xB3	Клавиша воспроизведения/паузы мультимедиа
VK_LAUNCH_MAIL	0xB4	Клавиша запуска почты
VK_LAUNCH_MEDIA_SELECT	0xB5	Клавиша выбора носителя
VK_LAUNCH_APP1	0xB6	Клавиша запуска приложения 1
VK_LAUNCH_APP2	0xB7	Клавиша запуска приложения 2
-	0xB8-B9	Зарезервировано
ВК_ОЕМ_1	0xBA	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры. Для стандартной клавиатуры США клавиша ‘;:’
ВК_ОЕМ_ПЛЮС	0xBB	Для любой страны/региона клавиша «+»
VK_OEM_COMMA	0xBC	Для любой страны/региона клавиша ‘,’
ВК_ОЕМ_МИНУС	0xBD	Для любой страны/региона клавиша «-»
VK_OEM_PERIOD	0xBE	Для любой страны/региона файл ‘.ключ
ВК_ОЕМ_2	0xBF	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры. Для стандартной клавиатуры США ‘/?’ ключ
ВК_ОЕМ_3	0xC0	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры. Для стандартной клавиатуры США клавиша «~»
-	0xC1-D7	Зарезервировано
-	0xD8-DA	Не назначено
ВК_ОЕМ_4	0xDB	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры. Для стандартной клавиатуры США клавиша ‘[{‘
ВК_ОЕМ_5	0xDC	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры. Для стандартной клавиатуры США ‘\|’ ключ
ВК_ОЕМ_6	0xDD	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры. Для стандартной клавиатуры США клавиша ‘]}’
ВК_ОЕМ_7	0xDE	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры.Для стандартной клавиатуры США клавиша «одинарная/двойная кавычка»
ВК_ОЕМ_8	0xDF	Используется для разных символов; это может варьироваться в зависимости от клавиатуры.
-	0xE0	Зарезервировано
	0xE1	Специально для OEM
ВК_ОЕМ_102	0xE2	Клавиши <> на стандартной клавиатуре США или \\| Клавиша на 102-клавишной клавиатуре не для США
	0xE3-E4	Специально для OEM
VK_PROCESSKEY	0xE5	Ключ ПРОЦЕСС IME
	0xE6	Специально для OEM
ВК_ПАКЕТ	0xE7	Используется для передачи символов Unicode, как если бы они были нажатиями клавиш. Ключ VK_PACKET — это младшее слово 32-битного значения виртуального ключа, используемое для методов ввода без клавиатуры. Для получения дополнительной информации см. примечание в KEYBDINPUT , SendInput , WM_KEYDOWN и WM_KEYUP
-	0xE8	Не назначено
	0xE9-F5	Специально для OEM
ВК_АТТН	0xF6	Кнопка Attn
VK_CRSEL	0xF7	Ключ CrSel
ВК_EXSEL	0xF8	Ключ ExSel
ВК_ЕРЕОФ	0xF9	Стереть клавишу EOF
ВКонтакте	0xFA	Ключ воспроизведения
ВК_ZOOM	0xFB	Клавиша масштабирования
ВКонтакте_NONAME	0xFC	Зарезервировано
ВК_ПА1	0xFD	Ключ PA1
VK_OEM_CLEAR	0xFE	Клавиша сброса

Требования

Требование	Значение
Минимальный поддерживаемый клиент	Windows 2000 Professional [только настольные приложения]
Минимальный поддерживаемый сервер	Windows 2000 Server [только настольные приложения]
Коллектор	Winuser. ч

Лучшие линии связи в приложении для знакомств (и худшие)

Источник: VK Studio/Shutterstock

«Вы, должно быть, устали, потому что весь день крутились у меня в голове». — Человек, которому вряд ли назначат свидание (цитируется по Senko & Fyffe, 2010)

Хорошо составленный профиль не поможет вам в приложении для знакомств. Чтобы произвести хорошее первое впечатление, вы также должны знать, что сказать, чтобы начать разговор.Правильная «линия перехвата» может быть разницей между сообщением, на которое приходит ответ, и сообщением, на которое распространяется радиомолчание.

Линия перехвата — это сообщения, которые вызывают интерес и открывают линии связи. В классическом исследовании свиданий Кляйнке и его коллеги выделили три типа фраз для разговора из списка распространенных способов начала разговора: легкомысленный, прямой и безобидный. Легкомысленные реплики пикапа были кокетливыми и юмористическими. Например: «Не холодно? Давайте сделаем немного тепла тела.«Прямые линии пикапа были комплиментарными и часто включали лесть. Например: «Ты кажешься другим. Я люблю это.» Безобидные реплики были тонкими и включали такие вопросы, как: «Вы видели какие-нибудь хорошие фильмы в последнее время?»

Кляйнке и др. также попросили людей оценить свои предпочтения в отношении различных типов линий выдачи заказов. Легкомысленные линии пикапа были наименее предпочтительными из трех типов, в то время как прямые и безобидные линии предпочитались больше всего. Почему легкомысленные линии пикапа работают так плохо? Сенко и Файфф обнаружили, что люди, которые использовали легкомысленные реплики, воспринимались как менее умные и заслуживающие доверия, чем те, кто использовал прямые и безобидные открытия — не совсем то, что вы хотите, пытаясь завязать разговор.

Телефонные линии для пикапа, которые люди используют в приложениях для знакомств

Распространив эту работу на приложения для знакомств, мы провели исследование, в ходе которого мы собрали и проанализировали сообщения людей потенциальному партнеру по знакомству до встречи. Мы также связались с ними после того, как они встретились, чтобы узнать, насколько вероятно, что они пойдут на второе свидание. Большинство людей использовали безобидные линии связи, чтобы инициировать контакт на сайтах онлайн-знакомств и в приложениях; например, один пользователь Tinder написал: «О, привет 😛 Как дела?» Мы также наблюдали легкомысленные и прямые линии в сообщениях людей, хотя и реже.В качестве примера легкомысленной реплики другой пользователь Tinder написал: «Когда я раздеваюсь в ванной, обычно включается душ». Не было никакой связи между типами линий пикапа, которые люди использовали, и их вероятностью второго свидания. Их вступительные реплики могли быть важны для свидания, но мало повлияли на то, что произошло после их встречи.

В недавнем исследовании Дай и Роббинс использовали эксперимент, чтобы проверить эффективность различных типов линий связи в контексте Tinder.Их результаты показали, что в приложениях для знакомств линии связи, которые люди используют, могут не иметь значения, если — и это большое, если — они привлекательны и обладают положительными качествами, такими как доброта, интеллект и дружелюбие.

Итак, в следующий раз, когда вы захотите завязать разговор в приложении для знакомств, попробуйте использовать настоящую вступительную фразу. Комплимент другому человеку или вопрос о чем-то, что выделяется из его профиля, может стать отличным способом начать разговор.

Изображение Facebook: VK Studio/Shutterstock

1/72 ВК 36.01(H) Тяжелый танк — Оружейная

1/72 ВК 36.01(Н)

Немецкий экспериментальный тяжелый танк времен Второй мировой войны

Оружейная — AR72210

Prawdę mówiąc, nawet nie wiedziałem, jak ten pojazd wygląda. Nie żebym się specjalnie interesował, бо Cała та menażeria protoplastów Tygrysa średnio mnie fascynuje, эля о Ile miałem świadomość istnienia Tego prototypu (ШОК bardziej bliźniaczej konstrukcji, czyli В.К. 30,01, на Бази której powstał Sturer Emil), чтобы Jak wygląda ро Raz pierwszy zobaczyłem на Boxarcie Jego Miniatury Z Оружейная

Boxarcie wcale efektownym. A jak wygląda rzeczony czołg? Jak filmowa przeróbka Pz.IV на Tygrysa. Rzecz jednak w tym, że istotnie, VK 36.01 był modyfikacją konstrukcji Pz.IV. С новым укладом выездным, мокнейским панцерземом и бардзией показала дорогу. I z tymi wieżami właśnie, o ile dobrze pamiętam, był jakiś проблема, toteż ostatecznie żaden z prototypów nie doczekał się uzbrojenia i skompletowania. Zatem – как розумием – презентована тута миниатюра для единой модели классы «что-если». Jak by nie było, do wyboru mamy dwie wieże, o czym informuje już grafika na boku pudełka

Pudełka dość okazalego, choć jednak wcale nie wypełnionego po brzegi plastikiem

Co nie znaczy, że model jest skromny.Его элементы znajdziemy w pięciu ramkach z plastiku oraz niemałej blaszce fototrawionej

Diagram z instrukcji stanowi nie tylko inwentaryzację zestawu, ale jest istotny o tyle, że to w nim znajduje się numeracja poszczególnych elementów

W komplecie jest również kalkomania…

…i zupełnie świadomie nie uzyłem tu określenia ‘arkusz’, bo jednak nie byłoby ono przesadnie adekwatne

Co zresztą ciekawe, w komplecie nie znajdziemy żadnych informacji na temat malowania. Prototypy najczęściej były ciemnoszare. I zazwyczaj bez oznaczeń. Zatem kolorowanie oraz wykorzystanie nalepek to już przedmiot do twórczejterpretacji przez modelarzy. Подобное узброение, бо до выбора, не тылко же кадлуби вис, эль и монтоване с дзяла

Rzecz jednak w tym, że jakość luf w modelu jest cokolwiek kontrowersyjna

Zatem w praktyce ta swoboda wyboru ograniczona jest dostępnością na rynku metalowych zamienników (tu nie robiłem rozpoznania).Powyższe zdjęcia nie pozostawiają też złudzeń – o ile całość jest ciekawym, szczegółowym opracowaniem, to za zupełnie udanym projektem technologia jednak nie nadąża. Sięgając po ten model trzeba się nastawić na żmudną obróbkę każdego elementu – czy to z drobnych nadlewek, czy to usuwanie drobnych skurczy, czy wreszcie wygladzenie powierzchni. Podkreślenia wymagać będą także niektóre detale. Ogólnie nie jest źle, ale wszystkie powyższe kwestie czynią ten zestaw przeznaczonym jednak doświadczonym modelarzom

Co warto zaznaczyć, blaszka z zestawu zawiera nie tylko bardziej filigranowe zamienniki detali plastikowych…

… але również интегральная фрагментарная модель

Układ jezdny budzi mieszane odczucia – jedne elementy są nawet szczegółowe, inne mają albo aparycję rzeźby gwoździem w mydle, albo mniej lub bardziej drobne skazy. Na szczęście, im bardziej exponowane powierzchnie czy detale, tym lepiej się prezentują, a te brzydkie rzeczy w gotowej miniaturze powinny być zupełnie ukryte. Dość przyzwoite są również gąsienice, podzielone na paski różnej długości oraz pojedyncze ogniwa

Podobna różnorodność jakościowa jest do zaobserwowania w przypadku wszelkiej drobnicy, w tym w narzędziach saperskich, reflektorach czy włazach. Skoro o nich mowa, to wszystkie dostajemy jako osobne elementy.Co więcej, wszystkie mają odpowiednie detale po obydwu stronach. Pamiętać jednak trzeba, że ​​wnętrze kadłuba jest zupełnie puste i pozbawione jakiegokolwiek wykończenia

Wieże różnią się nie tylko uzbrojeniem, ale mają jednak zupełnie różną konstrukcję – od samego kształtu, po wykończenie i detale, w tym kopułki dowódcy

Podsumowując – строительная миниатюра nietuzinkowej konstrukcji. Opracowanie на wysokim poziomie. Sęk jednak w tym, że temu opracowaniu nie sprostała narzędziownia. Компания, производящая продукцию, не была оптовиком, кто роби формирует и производит товары для ClearProp (одна од якиегось часу спорадические розыгрыши для Special Hobby ). Albo w ogóle jakiś productent modeli wielkoseryjnych – choć to ostatnie trudno byłoby uznać za uzasadnione ekonomicznie

КФС

 

Zestaw do recenzji został przekazany przez Armory Models

Дамские шаты VK Studio 65104

Дамские шаты VK Studio 65104 — Party21

Пржихлашени к вашему счету

Подсказка Výprodej

Состав: 97% полиэстер + 3% эластан

Описание: достойный и элегантный «маленький черный» прудовик.

 

Информация к великому:

— Velikost 36: обвод в прурамчих (v см): 41 см / обвод пашу (v см): 33 см / обвод бока (v см): 41 см / длина шатуна (см): 89 см

— Velikost 40: обвод в прурамчих (v см): 45 см / обвод пашу (v см): 37 см / обвод бока (v см): 45 см / длина шатуна (см): 89 см

— Velikost 42: обвод в прурамчих (v см): 47 см / обвод пашу (v см): 38 см / обвод бока (v см): 47 см / длина шатуна (см): 89 см

 

Co potřebujete najít?

Допоручумеме

‘;магазин. покупатель = {};shoptet.csrf = shoptet.csrf || {};shoptet.csrf.csrfToken = ‘SbYy5nlCee3df5f3eed8e72c’; Tento web používá soubory cookie.Dalším procházenim tohoto webu vyjadřujete souhlas s jejich používáním.. Více informací zde. Розумим

Přihlaste se prosím znovu

Omlouváme se, ale Váš CSRF token pravděpodobně vypršel. Abychom mohli udržet Vaši bezpečnost na co největší úrovni potřebujeme, abyste se znovu přihlásili.

Děkujeme za pochopení.

Vk Studio Amanigang, Dallan Chhapra

Vk Studio Amanigang находится в Даллан Чхапра, Баллия.В настоящее время у нас нет ни отзывов, ни оценок для Vk Studio Amanigang. В Даллан Чапра есть как минимум 2 фотостудии, из которых эта фотостудия имеет общий рейтинг 2. Адрес фотостудии: Межколледж Махатмы Ганди, Далан Чхапра, Уттар-Прадеш, 277204.

No 2

Vk Studio Аманиганг — Даллан Чафара — Баллия — Уттар Прадеш — полная информация
адрес	Mahatma Gandhi Inter College, Dalan Chhapra, Уттар Pradesh 277204
контакт	0717027
Площадь	Даллан Чхапра, Dokati, Джай Пракаш Нагар, Kodahara Uparwar, Murli Чхапра, Рам Нагар, Sonaki Бхат
Город	Балья
Общий зачет в 277204	🏅 Нет. 2 из двух не менее 2 фотографии студии в Ballia
No 2
рейтинг	3 на основе 1 отзывов

счет Студия фотографии возле VK Studio Amanigang
Расстояние	Photography Studios
Фотографии-студии
1
1
Фотографии-студии в пределах 2 км	1
Фотографии съемки в 5 км	1	1
студии фотографии в течение 10 км	1

Оформить заказ Top Photography Studios

• Мела Dadari Mela — Расстояние между VK Studio Amanigang и Dadari Mell — около 258.24 км.
• РЕСТОРАН SWAAD (ОТЕЛЬ BHARAT) — Расстояние между Vk Studio Amanigang и РЕСТОРАНОМ SWAAD (ОТЕЛЬ BHARAT) составляет примерно 256,61 км.
• Отель Park Inn — Расстояние между Vk Studio Amanigang и отелем Park Inn составляет примерно 256,46 км.

Адаптер убиквитинлигазы E3 Tango10 связывает основные циркадные часы с нейропептидными и поведенческими ритмами нейропептиды и нейротрансмиттеры.Здесь мы описываем ген

Tango10 , отвечающий за ежедневные поведенческие ритмы. TANGO10 действует как адаптер со своим партнером, убиквитинлигазой E3 CULLIN 3, для регуляции убиквитинирования белков, возбудимости нейронов через потенциалзависимые калиевые каналы и накопления нейропептидов. Эти исследования определяют механизм контроля возбудимости нейронов и суточной ритмичности.

Abstract

Циркадные транскрипционные хронометристы в нейронах кардиостимуляторов управляют глубокими суточными ритмами во сне и бодрствовании.Здесь мы раскрываем молекулярный путь, который связывает основные транскрипционные осцилляторы с нейронными и поведенческими ритмами. Используя два независимых генетических скрининга, мы идентифицировали мутантов транспорта и организации Гольджи 10 ( Tango10 ) с плохой ритмичностью поведения. Экспрессия Tango10 в нейронах водителя ритма, экспрессирующих нейропептид PIGMENT-DISPERSING FACTOR (PDF), необходима для устойчивых ритмов. Потеря Tango10 приводит к повышенному накоплению PDF в нервных окончаниях даже у мутантов, лишенных функциональных основных часов.Сам белок TANGO10 ритмично экспрессируется в окончаниях PDF. Масс-спектрометрия комплексов TANGO10 выявила взаимодействие с убиквитинлигазой E3 CULLIN 3 (CUL3). Фенокопии истощения CUL3 Tango10 мутантные эффекты на PDF даже в отсутствие основного гена часов timeless . Электрофизиология пэтч-кламп в мутантных нейронах Tango10 демонстрирует повышенное спонтанное срабатывание, потенциально связанное со снижением потенциалзависимых токов калия, подобных шейкеру. Мы предполагаем, что Tango10/Cul3 преобразует молекулярные колебания от основных часов к высвобождению нейропептидов, важных для поведенческих ритмов.

Циркадные (∼24 часа) часы управляют почти всеми аспектами поведения и физиологии в животном мире. Эти явные ежедневные поведенческие ритмы управляются колебательными петлями транскрипционной обратной связи, компоненты которых модифицируются фосфорилированием и убиквитинированием. У Drosophila гетеродимер CLOCK(CLK)-CYCLE(CYC) активирует транскрипцию с периодов ( per ) и вневременных ( tim ) промоторов (1, 2). PER и TIM обеспечивают обратную связь для ингибирования активности CLK-CYC и подавления собственной транскрипции.CLK-CYC также активирует активатор белка PAR-домена 1 ( Pdp1 ) и репрессор vrille ( vri ), которые по обратной связи контролируют транскрипцию Clk (3, 4). Посттранскрипционный контроль основных компонентов часов также играет решающую роль в поддержании молекулярных часов (5⇓⇓⇓⇓–10). Фосфорилирование часовых белков модулирует их внутриклеточную локализацию, активность и восприимчивость к убиквитин-зависимой деградации (11⇓⇓⇓⇓–16).

Колебания тактовой частоты примерно в 150 объединенных в сеть нейронах кардиостимуляторов ответственны за дискретные аспекты ритмического поведения. Особое значение имеют всего 10 экспрессирующих PDF нейронов водителя ритма (маленькие вентральные латеральные нейроны; sLNv), которые имеют решающее значение для свободных поведенческих ритмов. sLNv действуют как первичные водители ритма в условиях постоянной темноты (DD), синхронизируя циркадную фазу молекулярных часов среди PDF- и не-PDF-экспрессирующих групп часовых нейронов, включая дорсальные латеральные нейроны (LNd) и PDF-негативные sLNv. Потеря PDF или рецептора PDF (PDFR) приводит к резкому снижению свободной ритмичности, что подчеркивает решающую роль этого нейропептида (17⇓⇓⇓⇓⇓⇓–24).

Циркадные часы также регулируют несколько аспектов нейронного выхода кардиостимулятора. Регуляция часов способствует ритмичному накоплению уровней PDF (25) частично через vri , без включения или выключения переходного комплекса A / и канал утечки натрия узкий живот ( na ) (26⇓⇓– 29). Кроме того, часы также регулируют ежедневные структурные ритмы в окончаниях аксонов sLNv, включая изменения в ветвлении и фасцикуляции (30). Ритмы структурной пластичности могут быть опосредованы часовой регуляцией транскрипции vri , Myocyte Enhancer factor 2 ( Mef2 )/ Fasciclin 2 и Puratrophin-1-подобных (27, 31–34).Изменения в структурной пластичности, по-видимому, способствуют поведению в различных условиях окружающей среды, вероятно, за счет изменений сенсорных входов (34, 35). Тем не менее, колебания структурной пластичности или уровней PDF, вероятно, не являются существенными для ритмического поведения, поскольку штаммы, у которых отсутствуют эти ритмы, часто сохраняют сильную поведенческую ритмичность (31, 33, 34, 36), предполагая, что другие механизмы играют роль.

Циркадианные нейроны также демонстрируют суточные ритмы возбудимости (37⇓–39), что может быть частично опосредовано часовой регуляцией регулятора канала утечки натрия Nlf-1 и кальций-зависимого калиевого канала Slowpoke (30, 39, 40).Примечательно, что острое или хроническое гипервозбуждение нейронов PDF повышает уровни PDF и усиливает дефасцикуляцию окончаний sLNv (33, 41, 42), в то время как острое замалчивание имеет противоположные эффекты (43), указывая на то, что изменения возбудимости часовых нейронов могут влиять на уровни PDF и sLNv. морфология. Зависящие от часов и возбудимости изменения ветвления зависят от PDF/PDFR, подчеркивая критическую роль этого нейропептида (27, 42). Здесь мы демонстрируем, что TANGO10-CUL3 определяет циркадный выходной путь, важный для регулирования возбудимости нейронов кардиостимулятора и уровней PDF.Потеря TANGO10-CUL3 серьезно нарушает свободное ритмическое поведение, подчеркивая его решающую роль в выходе нейронов.

Результаты

Потеря BTB-адаптера Tango10 значительно снижает количество свободных ритмов.

Идентификация мутантов часов была важной стратегией для понимания того, как генетические компоненты формируют циркадное поведение и физиологию, связанную с часами. В рамках генетического скрининга (44) мы идентифицировали аллель вставки P-элемента Tango10 ( Tango10 ^GG ), который сильно снижает поведенческую ритмичность, сравнимую с самыми сильными зарегистрированными часовыми мутантами (рис.1 A и B и Приложение SI , рис. S1 и таблица S1). Tango10 ^GG Экстракты кочана не экспрессируют обнаруживаемый белок TANGO10, что соответствует сильной или полной потере функции аллеля (рис. 1 C и SI Приложение , рис. S2). Самки, трансгетерозиготные по Tango10 ^GG и хромосомным делециям локуса Tango10 , демонстрируют слабую ритмическую мощность, сходную с гемизиготными самцами мух (рис.1 D и SI Приложение , таблица S1). Важно отметить, что удаление элемента P или трансгенная экспрессия геномной конструкции Tango10 полностью реверсирует/спасает циркадную аритмичность мутантов Tango10 ^GG (рис. 1, E и SI, Приложение , таблица S).

Рис. 1.

Потеря Tango10 нарушает поведенческие ритмы. ( A ) Средние профили активности мутантных штаммов WT и Tango10 в течение 4 дней LD (белый и серый фон), а затем 7 дней DD (серый фон).Белый, светлая фаза; серая, темная фаза. n = от 34 до 59. ( B ) Схематические диаграммы локуса Tango10 и мутантных аллелей. Черные ящики, непереведенные регионы; белые ящики, кодирующие последовательности. Мутантный штамм Tango10 ^GG содержит инсерцию P-элемента в кодирующем экзоне (экзон 2), тогда как Tango10 ^bsr содержит EMS-опосредованную миссенс-мутацию в экзоне 3 (P462L), отмеченную звездочкой. ( C ) Белковые экстракты из WT, мутантов Tango10, и гетерозиготных мух, блотированных крысиными анти-TANGO10 и анти-синапсином в качестве контроля нагрузки.GG означает мутант Tango10 ^GG , тогда как bsr относится к мутанту Tango10 ^bsr . Необрезанные изображения были показаны в SI Приложение , рис. S2 A . ( D и E ) Локомоторная ритмичность, определенная анализом периодограммы χ ² в течение 7 дней DD. Столбики погрешностей указывают SEM. ( D ) Данные ритмичности комплемента от взрослых женских линий, как указано. Df1 относится к Df(1)ED7147 , тогда как Df2 относится к Df(1)BSC722 ( n = от 8 до 51).Статистическая значимость определена с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим сравнительным тестом Даннетта или двухфакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Тьюки со сравнениями с контролем WT (*** P < 0,001, * P < 0,05). ( E ) Указаны данные о ритмичности вырезания и восстановления генома у взрослых самцов. ΔGG указывает на точные (№ 5 и № 6) или имитационные (№ 1 и № 3) штаммы вырезания. [ Tango10 #1] и [ Tango10 #2] указывают на Tango10 геномных спасательных трансгенов ( n = от 12 до 71).Статистические сравнения, выполненные с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Даннета (эксцизия) или двухфакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Тьюки (спасение генома). Звездочками указано значительное отличие от соответствующего мутанта ( Tango10 ^GG или Tango10 ^bsr ) (*** P <0,001) ( SI Приложение , Таблицы S1 и S2).

Мы независимо друг от друга идентифицировали мутанта с помощью скрининга мутагенеза Х-хромосомы этилметансульфонатом (EMS) на предмет нарушения циркадных ритмов и поведения сна.Мы назвали этого мутанта busy run ( bsr ), основываясь на корейском слове, означающем «прилежный» и произносимом как [bu:zirʌn]. Мутанты bsr демонстрируют аритмическое двигательное поведение при DD, сравнимое с мутантами Tango10 ^GG (рис. 1, A и SI, Приложение , таблица S1). Тесты на комплементацию показали, что ни Tango10 ^GG , ни геномные делеции, охватывающие локус Tango10 , не спасают bsr мутантных фенотипов у трансгетерозиготных самок (рис.1 D и SI, Приложение , Таблица S1), предполагая, что bsr может быть рецессивным мутантным аллелем Tango10 . Чтобы оценить эту возможность, мы сравнили кодирующие последовательности Tango10 у мутантов дикого типа (WT) и bsr . Действительно, мы обнаружили миссенс-мутацию у мутантов bsr , которая превращает фенилаланин в положении аминокислоты 462 в лейцин (P462L) в пределах третьего кодирующего экзона Tango10 (рис. 1 B и SI Приложение , рис. .S3 А ). Выравнивание последовательностей показывает сильную консервативность этого остатка среди гомологов TANGO10, включая человека ( SI Приложение , рис. S3 B ), что указывает на его значение в структуре, стабильности или функции белков TANGO10. В соответствии с этой гипотезой мы обнаружили, что белки TANGO10 едва обнаруживаются в экстрактах головы мутантов bsr (рис. 1 C и SI Приложение , рис. S2). Наконец, геномный трансген, содержащий локус WT Tango10 , полностью восстанавливает циркадные фенотипы у мутантов bsr (рис. 1 E и SI Приложение , таблица S2). В совокупности эти генетические данные убедительно демонстрируют, что Tango10 является часовым геном, важность которого для поддержания высокоамплитудных ритмов сравнима с основными часовыми генами.

Функция Tango10 в нейронах PDF необходима для управления свободными ритмами.

Чтобы определить анатомические требования для Tango10 , мы использовали GAL4-UAS для экспрессии комплементарной ДНК WT Tango10 в мутантах Tango10 ^GG в определенных тканях и стадиях.Мы обнаружили, что специфичная для взрослых Tango10 индукция с использованием индуцируемой RU486 системы GeneSwitch либо пан-нейронно, либо повсеместно ( elav-geneswitch- GAL4 или дочерний-geneswitch- GAL4 соответственно) восстанавливает устойчивые поведенческие ритмы у Tango10 91 , что указывает на то, что Tango10 функционирует во взрослых нейронах (рис. 2 A и SI Приложение , таблица S3). Напротив, экспрессия Tango10 во всех ( tim -GAL4) или подмножествах ( Clk -GAL4, Pdf -GAL4) нейронов циркадного водителя ритма не восстанавливает мутантные ритмы Tango10 (рис.2 B и SI Приложение , таблица S4). Отсутствие спасения с использованием циркадных драйверов не может быть связано с гиперэкспрессией, так как гиперэкспрессия Tango10 с этими циркадианными драйверами на фоне WT не снижает ритмичности ( SI Приложение , Таблица S4), что позволяет предположить, что Tango10 может функционировать в несинхронных нейронах. поддерживать свободный двигательный ритм.

Fig. 2.

Tango10 экспрессия в нейронах PDF и специфичная для взрослой стадии экспрессия важны для поддержания ритмического поведения.Оценка поведенческой ритмичности у Tango10 мутантных, спасательных и РНК-интерференционных штаммов, определенная с помощью анализа периодограммы χ ² . GG обозначает мутантный аллель Tango10 ^GG . Столбики погрешностей указывают SEM. ( A ) Специфическое выражение взрослых Tango10 в Tango10 ^{GG GG GG GG Mutantants, использование ELAV-Geneswitch- Gal4 ( elav -G -G-GAL4) и GEAL4 ( DA -GS-GAL4).Мухи, у которых экспрессия Tango10 индуцируется во взрослом состоянии (RU486), проявляют повышенную поведенческую ритмичность по сравнению с мухами, которых кормили этанолом (EtOH, контроль носителя) ( n = от 8 до 22). Статистическая значимость определена тестом Стьюдента t (*** P <0,001). ( B ) 30Y — GAL4-DRICED Tango10 Эксплуатация REPTMICITY Tango10 GG Mutants в отличие от циркадных Gal4s, в том числе PDF- Gal4, Tim- Gal4, и CLK- Gal4 ( н = от 19 до 34).Статистическую значимость между скрещенными линиями GAL4 и скрещенным контролем iso31 определяли с помощью теста Стьюдента t (** P <0,01). ( C ) elav — и Pdf -GAL80 заблокировал спасение ритмичности на 30Y — GAL4 управляемый Tango10 выражение ( n = от 15 до 39). Статистическую значимость определяли с помощью одностороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Даннета. (ns, не значимо; *** P < 0.001). ( D ) Опосредованное РНКи истощение TANGO10 в фенокопиях часовых нейронов Tango10 GG мутантов. UAS- Dicer2 был объединен с драйвером GAL4 (GAL4> Dcr2 ) для повышения эффективности РНКи ( n = от 32 до 44). Статистическую значимость определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия Даннетта *** P <0,001) ( SI Приложение , таблицы S3 и S4).}

Чтобы сузить анатомический локус, необходимый для Tango10 -зависимых часов, мы объединили более широкое спасение GAL4 с различными трансгенами GAL80, чтобы заблокировать индукцию GAL4 в определенных подмножествах нейронов. Мы использовали широко экспрессирующийся GAL4, 30Y — GAL4 (45), который достоверно восстанавливает ритмичность у мутантов Tango10 (рис. 2, B, и SI, Приложение , таблица S4). Управляемое 30Y спасение Tango10 заблокировано с использованием паннейронального elav -GAL80, что подтверждает требование нейрона Tango10 (рис. 2 C и SI Приложение , таблица S4). 30Y заметно активен в нейронах грибовидных тел (MB) (45), однако специфический для MB GAL80, 247- GAL80, не блокирует восстановление.С другой стороны, блокирование 30Y конкретно в нейронах PDF существенно подавляло восстановление поведенческих ритмов (рис. 2, , C, и , Приложение SI, таблица S4). Таким образом, функция Tango10 в нейронах PDF необходима для управления свободными ритмами.

Чтобы подтвердить необходимость Tango10 в нейронах PDF, мы подавляли эндогенную экспрессию Tango10 в выбранных нейронах с помощью РНК-интерференции (РНКи) и исследовали влияние на циркадные локомоторные ритмы. Сначала мы подтвердили, что паннейрональная экспрессия трансгена Tango10 RNAi эффективно истощает эндогенные белки TANGO10 в экстрактах головы мухи, что указывает на эффективность RNAi и экспрессию TANGO10 в нейронах ( SI, Приложение , рис. S4). Кроме того, мы обнаружили, что истощение Tango10 в нейронах PDF, но не в нейронах MB, приводит к поведенческой аритмии, сравнимой с таковой у мутантов Tango10 (рис. 2 D и SI Приложение , таблица S4).В совокупности эти данные демонстрируют, что Tango10 в нейронах PDF необходимы, но недостаточны для надежной ритмичности циркадного локомоторного поведения.

Потеря функции Tango10 избирательно влияет на небольшие колебания LNv PER и TIM.

Суточная ритмическая экспрессия часовых белков лежит в основе циркадного локомоторного поведения. Таким образом, мы исследовали ежедневную экспрессию белков основных часов PER и TIM как меру молекулярных часов. Иммуноблоттинг экстрактов головы взрослых особей в циркадное время (CT) 3 и CT15 показал сопоставимые уровни PER и TIM между WT и мутантами Tango10 ( SI Приложение , рис. С5). Мы также оценили ритмы PER и TIM в цикле свет:темнота (LD) (т. е. 12 часов света: 12 часов темноты) в отдельных группах нейронов циркадных кардиостимуляторов: PDF+ sLNv и большой LNv (lLNv) и PDF-LNd и пятый сЛНв (рис. 3). Осцилляции PER и TIM проявлялись во всех группах нейронов как у мутантов WT, так и у мутантов Tango10 (рис. 3). Более того, в большинстве этих групп уровни и амплитуда колебаний были сопоставимы между WT и мутантами Tango10 , хотя умеренные зависящие от времени изменения уровней белка согласуются с небольшой задержкой фазы у мутантов Tango10 (рис.3). Tango10 sLNv проявляют наиболее заметные эффекты с умеренным примерно на 30% снижением пиковых уровней PER (2,5-кратное колебание у WT и 1,9-кратное у Tango10 ) и снижением примерно на 60% уровней TIM, хотя уровни TIM все еще колеблются. достоверно (∼3×; рис. 3). Сходные результаты были получены при свободно протекающей ДД, когда у мутантов Tango10 исчезают циркадные локомоторные ритмы ( SI Приложение , рис. S6).

Рис. 3.

Осцилляции часов затухают у Tango10 мутанта sLNv.( A и B ) Уровни PER и TIM количественно определяли по отдельным группам нейронов циркадных кардиостимуляторов во время цикла LD. Средняя интенсивность в WT на ZT 2 была принята равной 1 для нормализации. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 14 до 18 полушарий из двух экспериментов). Измерения WT и Tango10 сравнивались в каждый момент времени с использованием теста Стьюдента t (* P <0,05, ** P <0,01). lLNv, большой вентральный латеральный нейрон; sLNv, малый вентральный латеральный нейрон; пятый LNv, PDF-отрицательный LNv; LNd, дорсо-латеральный нейрон.( C и D ) Репрезентативные конфокальные изображения WT и Tango10 ^GG мутантного sLNv.

Потеря Tango10 резко повышает уровни PDF в терминалах часовых нейронов.

Обнаружение устойчивых молекулярных колебаний с уменьшенной амплитудой позволяет предположить, что Tango10 может функционировать для регуляции выхода нейронов PDF. Считается, что молекулярные часы частично передают информацию о времени через суточный ритм в циркадном нейропептиде PDF.Чтобы оценить влияние Tango10 на PDF, мы исследовали накопление PDF на дорсальных аксональных окончаниях sLNv. WT sLNv демонстрируют устойчивые ритмы PDF с пиковыми уровнями через 2 часа после включения света в цикле LD (т. е. время Zeitgeber [ZT] 2; включение света в ZT0; выключение света в ZT12) (рис. 4 A и Б ) (25). Однако мутантный sLNv Tango10 демонстрировал постоянно высокие уровни PDF на окончаниях аксонов, подавляя ритмы PDF как в цикле LD ( A и B ), так и в цикле DD ( SI Приложение , рис.С7). Кроме того, структурная ритмичность в терминалях sLNv была подавлена ​​мутацией Tango10 , тогда как тела клеток Tango10 sLNv демонстрировали колебания PDF, сравнимые с WT (Fig. 4 C и D ). Эффекты Tango10 на уровни PDF были также обнаружены на терминалах lLNv в оптической доле, так как Tango10 lLNv не показал существенных изменений в терминальных уровнях PDF ( SI Приложение , рис. S8). Учитывая, что циркадные часы регулируют уровни PDF на терминалах sLNv (25), а Tango10 влияет на уровни TIM, мы задались вопросом, требуют ли высокие уровни PDF в Tango10 мутантных sLNv tim .Соответственно, мы создали двойные мутанты Tango10 ^GG и tim ⁰¹ и исследовали экспрессию их PDF. Мы обнаружили, что потеря Tango10 приводит к повышенным уровням PDF даже на фоне нулевых мутантов tim (рис. 4 E ), что указывает на то, что tim не требуется для Tango10 регуляции PDF.

Рис. 4.

Потеря Tango10 приводит к повышению PDF при отсутствии tim .( A ) Репрезентативные z-суммированные проекционные изображения максимальной интенсивности окрашивания PDF в дорсальных окончаниях sLNv в условиях LD. ZT, время Zeitgeber. ( B ) Количественная оценка интенсивности PDF в дорсальной проекции sLNv. Изображения срезов складывались в виде проекций максимальной интенсивности. Интегральные интенсивности выше порога измеряли и нормализовали к усредненному измерению Tango10 ^GG мутанта на ZT2 (установлено как 1). Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 14 до 22 полушарий из двух экспериментов).Измерения WT и Tango10 сравнивали в каждый момент времени с использованием теста Стьюдента t (* P <0,05, ** P <0,01). ( C ) Количественная оценка разветвления sLNv в дорсальных проекциях ( слева ) и экспрессии PDF в телах клеток sLNv ( справа ). Аксональные перекресты измеряли с помощью анализа Шолля. Интенсивность PDF в клеточных телах sLNv была нормализована к усредненному измерению WT в ZT2 (установлено как 1). GG означает мутант Tango10 ^GG .Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 17 до 23 полушарий для разветвления sLNv; n = от 16 до 18 полушарий для клеточных тел sLNv). Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительные эффекты взаимодействия генотип × момент времени на общее количество скрещиваний аксонов в дорсальных проекциях sLNv ( P = 0,0037), но не на уровни PDF в клеточных телах sLNv ( P = 0,8904), тогда как Tango10 влияет на оба измерения были значимыми ( P < 0,0001 и P = 0.0010 соответственно). нс, не значимо; * P < 0,05, ** P < 0,01, как определено апостериорным тестом Тьюки. ( D ) Скрещивания аксонов для каждого концентрического кольца анализировали в WT и Tango10 ^GG мутантных sLNv. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 17 до 23 полушарий из двух экспериментов). * P < 0,05, ** P < 0,01 по данным теста Стьюдента t . ( E ) Репрезентативные изображения и количественная оценка сигналов анти-PDF в дорсальных проекциях tim ⁰¹ или Tango10 ^GG tim ⁰¹ мутантного sLNv на ZT15. Интегральные интенсивности окрашивания анти-PDF выше порога измеряли и нормализовали к усредненному измерению tim ⁰¹ мутанта (установленного как 1). Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 22 до 24). ** P <0,01, как определено с помощью теста Стьюдента t .

Затем мы изучили субклеточную локализацию TANGO10, чтобы определить, как он может вызывать эффекты потери функции на PDF. К сожалению, наше антитело против TANGO10 не смогло обнаружить эндогенные белки TANGO10 в цельном препарате головного мозга с помощью иммунного окрашивания.Таким образом, мы экспрессировали трансгенные белки TANGO10 с эпитопной меткой HA, чтобы визуализировать экспрессию в нейронах PDF. Мы подтвердили, что трансген Tango10-HA сильно восстанавливает мутантные ритмы Tango10 , указывая на то, что он функционален (рис. 5 A ). При экспрессии в нейронах PDF трансгенный TANGO10-HA демонстрирует точечную локализацию в аксональном тракте и окончаниях нейронов sLNv (Fig. 5 B ). Мы наблюдаем частичную колокализацию между экспрессией PDF и TANGO10-HA в окончаниях sLNv, при этом TANGO10 демонстрирует несколько более широкую локализацию (рис.5 В ). Более того, наш количественный анализ выявил надежные ритмы TANGO10 на аксональных окончаниях sLNv в циклах LD (рис. 5 C и D ; пик ZT10, впадина ZT22). Эти данные свидетельствуют о том, что ритмичная экспрессия TANGO10 в дорсальных окончаниях находится ниже циркадных часов и, в свою очередь, может вносить вклад в ритмические уровни PDF.

Рис. 5.

Трансгенный белок TANGO10 локализуется и осциллирует в дорсальных окончаниях нейронов PDF. ( A ) 30Y — GAL4-управляемая экспрессия Tango10 -HA восстанавливает поведенческую ритмичность у Tango10 ^GG мутантов (GG), проанализировано в течение 7 дней DD с использованием анализа χ 5 периодограмм 92.Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 16 до 24). *** P < 0,001, как определено с помощью теста Стьюдента t . ( B ) Репрезентативные конфокальные изображения дорсальных терминалей sLNv, экспрессирующих PDF (зеленый) и TANGO10-HA (красный) на ZT 15. ( C и D ) Pdf- GAL4-управляемые циклы TANGO10-HA в sLNv дорсальные проекции. Количественную оценку сигналов TANGO10-HA и PDF проводили, как показано на рис. 4. Интенсивность TANGO10-HA или PDF на ZT2 была установлена ​​равной 1.Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 27 до 38 из трех независимых экспериментов). Цикличность TANGO10-HA была обнаружена с помощью одностороннего ANOVA ( P <0,0001). Были показаны репрезентативные проекционные изображения окрашивания TANGO10-HA с максимальной интенсивностью в мозге Pdf- GAL4 UAS- Tango10 -HA.

Протеомный анализ Идентифицирует CUL3 как TANGO10-Interacting Partner.

Множественные выравнивания последовательностей показывают, что домены BTB/POZ и BACK, участвующие в белок-белковых взаимодействиях, хорошо консервативны среди гомологов TANGO10 ( Приложение SI , рис. S3 В ). Соответственно, мы провели протеомный анализ иммунопреципитированных белковых комплексов TANGO10 из голов мух, чтобы идентифицировать факторы, опосредующие Tango10 -зависимую функцию часов in vivo. Сначала мы подтвердили, что С-концевая тройная метка FLAG не мешает функции WT Tango10 , поскольку паннейронная экспрессия FLAG-меченной TANGO10 восстанавливает поведенческие фенотипы у мутантов Tango10 ( SI Приложение , Таблица S5). Мы экспрессировали TANGO10 с меткой FLAG либо в часовых клетках дикого типа, используя tim -GAL4, либо во всех постмитотических нейронах, используя elav -GAL4.Белковый комплекс, связанный с FLAG-меченым TANGO10, был затем аффинно очищен путем иммунопреципитации в ZT10 и ZT22 и проанализирован с помощью масс-спектрометрии. Чтобы идентифицировать «попадания», мы искали белки, которые были обнаружены по крайней мере в двух из четырех образцов, но не присутствовали ни в контрольных образцах GAL4/+, ни в иммунопреципитации фактора трансляции часов TWENTY-FOUR (6). Эта стратегия выявила 21 перекрывающийся результат независимого протеомного анализа ( SI Приложение , Таблица S6). Интересно, что лигаза E3 CUL3 была идентифицирована как один из перекрывающихся хитов, присутствующих как в образцах tim- GAL4, так и в одном из двух образцов elav -GAL4.Предполагается, что CUL3 играет роль в убиквитинировании TIM, способствуя высокоамплитудному циклированию TIM и поведенческим ритмам (16, 46, 47). TANGO10 и CUL3 коиммунопреципитируют из клеток Drosophila S2 при временной трансфекции. (Рис. 6 A ). Мы также наблюдали, что эндогенный CUL3 коиммунопреципитирует с tim- GAL4-управляемыми FLAG-мечеными TANGO10, что еще раз подтверждает их взаимодействие in vivo (рис. 6 B ). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что TANGO10 и CUL3 образуют белковый комплекс для поддержания циркадных ритмов.

Рис. 6.

Истощение интерактора TANGO10 CUL3 в фенокопиях нейронов PDF Фенотипы экспрессии PDF наблюдаются у мутантов Tango10 в отсутствие tim . ( A ) Коиммунопреципитация (IP) CUL3 и TANGO10 в клетках Drosophila S2. Репрезентативные иммуноблоты входных и IP-образцов из клеток S2, котрансфицированных векторами экспрессии для CUL3-V5 и TANGO10-HA, как указано. ( B ) Совместная IP CUL3 и TANGO10 в головах Drosophila .Иммуноблоттинг-анализ входных и IP-образцов из экстрактов головы взрослых особей при трансгенной экспрессии TANGO10, меченного FLAG, с использованием tim -GAL4 по сравнению с контролем tim -GAL4/+, проанализированным с помощью антител против FLAG и против CUL3. CUL3 обнаруживается во входных блотах, а также в IP-блотах для образцов, экспрессирующих TANGO10 с маркировкой FLAG. Звездочка указывает на неспецифические полосы, наблюдаемые в обоих образцах IP независимо от трансгена Tango10 -3xFLAG, но размер этой полосы больше, чем у CUL3.( C ) Истощение CUL3 в циркадных нейронах водителя ритма, включая клетки PDF+, вызывает снижение ритмичности. Cul3 RNAi относится к штамму NIG 11861R-2; Pdf > Dcr2 , Pdf- GAL4 UAS- Dcr2 ; тим > Dcr2 , тим- GAL4 UAS- Dcr2 . Мощность ритмичности определяли по периодограмме χ ² . Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 8 до 44). *** Р < 0.001, как определено тестом Стьюдента t . См. также Приложение SI , Таблица S7. ( D ) Истощение CUL3 увеличивает интенсивность PDF в дорсальных проекциях sLNv на ZT 14 в отсутствие tim . Сигналы PDF анализировали, как показано на рис. 4. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего ( n = от 14 до 16 из двух независимых экспериментов). Двусторонний дисперсионный анализ выявил значительное влияние Cul3 на уровни PDF ( P <0,0001), но не их взаимодействие с и ( P = 0.0599). *** P <0,001, как определено тестом множественных сравнений Тьюки. ( E ) Репрезентативные изображения окрашивания в формате PDF дорсальной проекции CUL3-истощенного sLNv и контроля РНКи на фоне tim + или tim ⁰¹ на фоне ZT14.

Истощение CUL3 Фенокопирует поведенческие ритмы и уровни PDF мутантов Tango10.

Для оценки функции Cul3 в нейронах PDF мы использовали Pdf- GAL4-управляемую Cul3 РНКи.Мы обнаружили, что истощение CUL3 в нейронах PDF сильно ослабляет локомоторные ритмы при свободном течении DD (рис. 6 C и SI Приложение , таблица S7), что согласуется с предыдущим отчетом (16). Затем мы определили, влияет ли Cul3 , как и Tango10 , на уровни PDF, и обнаружили, что уровни PDF постоянно высоки в окончаниях аксонов CUL3-истощенной sLNv (рис. 6 D и E ), фенокопируя эффекты из Tango10 мутантов. Учитывая предполагаемые связи между CUL3 и TIM, мы оценили эффекты Cul3 на нулевом фоне tim ( tim ⁰¹ ) и обнаружили повышенные уровни PDF, сходные с наблюдаемыми у мутантов Tango10 (рис. 6 D и E ), поддерживая роль Cul3 в PDF в отсутствие tim . Биохимическая ассоциация и фенотипическое сходство Cul3 и Tango10 побудили нас выдвинуть гипотезу о том, что CUL3 использует TANGO10 в качестве адаптера для управления PDF и поведенческими ритмами ниже молекулярных часов.

Потеря Tango10 увеличивает скорострельность и деполяризует мембранный потенциал.

Уровни PDF в окончаниях аксонов также зависят от возбудимости нейронов (41, 42).Чтобы исследовать влияние мутации Tango10 на возбудимость, мы выполнили электрофизиологию цельноклеточного участка на PDF-экспрессирующем lLNv. Электрофизиология lLNv хорошо изучена, так как их расположение вблизи поверхности мозга и большой сомы делает их более доступными по сравнению с другими нейронами мушек. Мы обнаружили, что Tango10 мутантный lLNv проявляют повышенную возбудимость по сравнению с WT (Фиг.7 A ). Частота срабатывания Tango10 lLNv значительно выше по сравнению с WT lLNv (рис. 7 Б ). Увеличение частоты возбуждения Tango10 lLNv связано с более деполяризованным мембранным потенциалом (рис. 7 C , P <0,01). Входное сопротивление lLNv было измерено с использованием протокола подачи гиперполяризующего тока, при этом не было обнаружено существенной разницы между WT и Tango10 (рис. 7 D ). Емкость клеток определяли по шагу тока, измеренному в режиме фиксации напряжения, при этом было обнаружено, что нейронов Tango10 lLNv имеют значительно более низкую емкость по сравнению с WT в утренние часы (рис.7 E ). Тем не менее, обнаружение повышенной возбудимости в Tango10 мутантных нейронах согласуется с ролью в нейронном выходе.

Рис. 7.

Потеря Tango10 повышает возбудимость нейронов PDF. ( A ) Репрезентативные записи токовых клещей на ZT0~4 ( Верх ) и ZT8~12 ( Низ ) WT ( Левый ) и Tango10 ^GG

5 (Правый). ( B ) Сводные гистограммы, показывающие среднюю скорострельность WT ( n = 18 при ZT0~4; n = 21 при ZT8~12) и Tango10 ^GG мутант (

1 при n ZT0∼4; n = 19 при ZT8∼12). ( C ) Сводные гистограммы, показывающие средний мембранный потенциал (MP) WT ( n = 18 при ZT0~4; n = 21 при ZT8~12) и мутант Tango10 ^GG 3 (

1 = 19 при ZT0∼4, n = 19 при ZT8∼12). Данные представляют собой средние значения ± SEM ** P < 0,01, как определено с помощью теста Стьюдента t . ( D ) Входное сопротивление было измерено в токовых клещах по реакции напряжения на скачки гиперполяризующего тока. Не было обнаружено различий между WT и Tango10 ^GG как утром, так и вечером (тест Стьюдента t ).( E ) Емкость клеток Tango10 мутантного lLNv значительно ниже, чем у WT в утренние часы (** P <0,01), но не вечером ( P = 0,11), как определено тестом Стьюдента t .

4-AP-Sensitive I

_A Поток калия значительно снижен в Tango10 Mutant lLNv.

Чтобы исследовать, какие ионные каналы могут быть опосредованными различиями в Tango10 мутантном lLNv, мы использовали электрофизиологию фиксации напряжения. Мы наблюдали потенциалзависимый внешний ток с быстро- и медленно инактивирующими компонентами (рис. 8 —). Мы отметили, что у мутантов Tango10 снижен быстро-но не медленно-инактивирующий компонент (рис. 8 A – C ). Затем мы использовали фармакологию, чтобы заблокировать подмножества калиевых каналов для дальнейшего изучения механизмов, лежащих в основе гипервозбудимости. Токи целых клеток регистрировали в присутствии тетродотоксина (ТТХ) для блокирования натриевых каналов, а затем повторяли тот же протокол фиксации напряжения с добавлением тетраэтиламмония (ТЭА) для блокирования потенциалозависимых калиевых каналов.ТЭА-чувствительный ток рассчитывали путем вычитания токов, измеренных в двух условиях (рис. 8 D ). Не было обнаружено существенных различий в токе, чувствительном к TEA, между WT и Tango10 (рис. 8 E ). Для дальнейшего изучения токов калиевых каналов был выполнен тот же протокол фиксации напряжения с дальнейшим добавлением 4-аминопиридина (4-AP) к раствору, при этом ток, чувствительный к 4-AP, снова рассчитывался с использованием вычитания токов, вызванных в два условия. Выделение 4-AP-чувствительного тока выявило значительное снижение Tango10 lLNv (рис. 8 D и F ). Кинетика инактивации и фармакологическая специфичность этого тока идентифицируют уменьшенный Shaker-подобный ток (I _A ) у мутантов Tango10 .

Рис. 8.

Пониженный I _Ток у мутантов Tango10 может лежать в основе повышенной скорострельности. ( A ) Следы тока всей клетки, индуцированные ступенчатым импульсом, до потенциалов от -120 до +100 мВ с приращением 10 мВ в WT ( Верх ) и мутант Tango10 ^GG ( Нижний ).Импульсные протоколы для записи токов целых клеток ( , вкладыш ). ( B и C ) графики ток-напряжение показывают средние плотности тока всей клетки для пикового тока (IK быстрый) и поздней части (IK медленный) тока lLNv в WT ( n = 14 при ZT0~4; n = 12 в 8~12) и мутант Tango10 ^GG ( n = 17 в ZT0~4; n = 13 в ZT8~12). Амплитуда быстрого тока IK была значительно ниже у Tango10 ^GG мутанта lLNv по сравнению с диким типом (двусторонний ANOVA, P < 0.0001). (WT ZT0~4 по сравнению с GG ZT0~4, WT ZT8~12 по сравнению с GG ZT8~12; P < 0,05 по двухфакторному дисперсионному анализу; ^# P < 0,05 ВСД] тест). ( D ) TEA-чувствительный внешний ток ( Верх трасс) и 4-AP-чувствительный внешний ток ( Нижний трассы) соответственно. ( E ) IV показывают средние ТЭА-чувствительные плотности тока lLNv у WT ( n = 7 при ZT0~4; n = 6 при 8~12) и Tango10 ^GG мутант ( 3 91 912 мутант = 5 при ZT0∼4, n = 7 при ZT8∼12).( F ) IV показывают средние 4-AP-чувствительные плотности тока lLNv у WT ( n = 7 при ZT0~4; n = 6 при 8~12) и Tango10 ^GG 92 мутант ( n = 5 при ZT0∼4, n = 7 при ZT8∼12). Амплитуда 4-AP-чувствительного тока была значительно ниже у Tango10 ^GG мутантного lLNv по сравнению с животным дикого типа (двусторонний ANOVA, P <0,0001) (WT ZT0~4 по сравнению с GG ZT0~4, WT ZT8~12 против GG ZT8~12, P < 0.05 двухфакторным дисперсионным анализом; ^# P < 0,05, тест Тьюки HSD). ( G ) Моделирование математических моделей WT ( Верхний след, частота импульсов ∼1 Гц) и Tango10 мутант lLNv ( Нижний след, частота импульсов ∼4 Гц). ( H ) Скорость горения модели как функция процентного снижения тока Shaker/Shal, с красной точкой (уменьшение на 30 %) и серой точкой (уменьшение на 0 %), что соответствует моделям Tango10, и WT, показанным на рис. .8 G соответственно.

Чтобы определить, может ли снижение тока I _A объяснить повышенную скорость стрельбы, наблюдаемую у мутантов Tango10 , мы разработали математическую модель электрофизиологии lLNv ( SI Приложение , Таблица S8). Наша модель основана на модели Смита для lLNv (48), которая включает в себя входящий натриевый ток, входящий кальциевый ток, ток утечки и четыре исходящих калиевых потока: быстро инактивирующие токи А-типа Шейкера и Шала и медленно- или неинактивирующие токи Шаб и Шоу.В модели Смита параметры калиевого тока соответствовали данным фиксации напряжения, изолирующим эти токи в lLNv, тогда как параметры тока натрия и кальция были взяты из ранее опубликованной модели циркадианных часовых нейронов млекопитающих (49). Для нашей модели мы сохранили текущие параметры калия модели Смита, но изменили текущие параметры натрия и кальция на данные фиксации тока из lLNv, используя ассимиляцию данных (DA), метод оценки состояния и параметров для оптимального объединения динамических моделей с наблюдениями ( Materials). и Способы ).Этот подход дал модель, которая точно соответствует частоте возбуждения и форме потенциала действия (ПД), наблюдаемой в записях WT LNv (рис. 8 G и SI Приложение , рис. S9 и S10). Затем мы смоделировали модель с уменьшенными значениями параметра максимальной проводимости для токов Шейкера и Шала. Мы обнаружили, что снижение токов Shaker/Shal на 30% может воспроизвести фенотип повышенной скорости стрельбы мутантов Tango10 (рис. 8, G и H ).

Чтобы экспериментально проверить вклад TEA- и 4-AP-чувствительных токов в нейрофизиологию ИЛНв, мы измерили влияние фармакологического применения соответствующих препаратов на мембранный потенциал покоя, измеренный в присутствии ТТХ. Применение ТЭА приводило к небольшой деполяризации мембранного потенциала (примерно от 1 до 2 мВ) как утром, так и вечером, без каких-либо различий между Tango10 и WT ( SI Приложение , рис. S11 A и B ).Однако применение 4-АР вызывало большую деполяризацию (примерно от 5 до 10 мВ) у WT lLNv со значительно меньшим ответом у Tango10 lLNv, проявляющимся вечером ( SI Приложение , рис. S11 A и C ), предоставляя дополнительные доказательства снижения 4-AP-чувствительного тока в Tango10 lLNv. Интересно, что экспрессия гена Shal и текущие уровни более повышены вечером, что согласуется с этими эффектами 4-AP (48, 50).

Обсуждение

Чтобы обнаружить гены, участвующие в циркадианном поведении, мы провели два крупномасштабных генетических скрининга: один на основе кандидата Р-элемента, а другой — объективный химический мутагенез. Эти разные подходы независимо идентифицировали мутанты Tango10 , подчеркивая их ключевую роль. Эти мутанты сильно нарушают свободную ритмичность. Кроме того, потеря Tango10 приводит к резкому накоплению PDF в окончаниях часовых нейронов и потере ритмов накопления PDF.Эти эффекты сохраняются при отсутствии функционирующих базовых часов. Чтобы лучше понять молекулярные механизмы, с помощью которых функционирует Tango10 , мы проанализировали комплексы TANGO10 с помощью иммунопреципитации и масс-спектрометрии и обнаружили взаимодействия с убиквитинлигазой E3 CUL3. Истощение CUL3 также приводит к аналогичным эффектам накопления PDF. Электрофизиология патч-кламп нейронов PDF демонстрирует повышенную возбудимость и снижение шейкероподобных калиевых токов, предполагая, что эффекты Cul3/Tango10 проявляются через повышенную возбудимость.Уровни белка TANGO10 также колеблются в этих окончаниях, предполагая, что они находятся под часовым контролем и вносят вклад в клеточные ритмы. В совокупности это исследование раскрывает критический убиквитин-протеасомный путь, с помощью которого временная информация передается клеточным и поведенческим выводам ( SI Приложение , рис. S12).

В этой работе освещается выходной путь нейронов с удивительно устойчивым воздействием на свободные циркадные ритмы. Потеря Tango10 с двумя независимыми аллелями приводит к существенному снижению ритмической силы (примерно 95% снижение значимости мощности [PS] для аллеля GG).Независимые аллели были обнаружены в двух скринингах по фенотипу. Сила фенотипа ритмичности контрастирует с теми, о которых сообщалось ранее для аллелей потери функции других предполагаемых выходных генов. Большая часть известных работ по изучению выходных сигналов циркадных нейронов была сосредоточена на фасцикуляции/дефасцикуляции ветвей аксонов (33, 34). В то время как золотой стандарт генетики потери функции (например, РНК-интерференция или доминантно-негативные манипуляции) оказывает глубокое влияние на нервные состояния ритмических фасцикуляций (см.34) они оказывают ограниченное влияние на решающий функциональный выход этих нейронов, циркадное поведение (см. рис. 4 D ; Rho1DN в ссылке 34; и таблицу 2 Pdf > Mef2 RNAi в ссылке 33). Единственными исследованиями, в которых наблюдались большие циркадные поведенческие фенотипы в результате генетических манипуляций с потерей функции, являются те, которые нацелены на сам нейропептид PDF, а также на субъединицы ионного канала NA и его регулятор NLF-1, которые функционируют посредством возбудимости (20). , 39, 51). Наше открытие, что Tango10 оказывает сильное влияние на ритмичность свободного бега, указывает на то, что он определяет особый путь, решающий для ритмичности свободного бега.

Используя специфическое генетическое восстановление клеток и количественную иммунофлуоресценцию, мы продемонстрировали, что Tango10 влияет на картирование ритмичности всего примерно на 20 часовых нейронов, экспрессирующих нейропептид PDF. Нокдаун RNAi, в частности, в LNv, нарушает свободную ритмичность, и экспрессия LNv необходима для надежного восстановления Tango10 фенотипа ритмичности, хотя Tango10 в несинхронных нейронах вносит дополнительный вклад в свободную ритмичность. Кроме того, эффекты Tango10 и Cul3 на молекулярные часы в основном наблюдаются в группе sLNv, а не в других группах нейронов водителя ритма (рис.16). В совокупности наши данные указывают на критическую функциональную потребность в TANGO10-CUL3 в PDF-позитивных LNv для обеспечения молекулярной и поведенческой ритмичности.

Мы продемонстрировали, что Tango10 , вероятно, функционирует совместно с убиквитинлигазой E3 CUL3, тем самым определяя роль убиквитинирования белка в нейрональном выходе. Эксперименты по протеомной и коиммунопреципитации (Co-IP) показывают, что CUL3 и TANGO10 взаимодействуют in vivo. Потеря функции Tango10 или Cul3 в нейронах PDF вызывает сопоставимую аритмичность.Более того, снижение функции Tango10 или Cul3 также приводит к сходным молекулярным фенотипам, включая повышение уровней PDF даже в отсутствие tim . Убиквитинирование может служить сигналом для деградации белков и/или транспорта белков к клеточной мембране (52, 53). Будет интересно изучить функцию других белков, взаимодействующих с TANGO10, как потенциальных ферментативных мишеней этого комплекса.

В данной модели ( СИ Приложение , рис.S12), наблюдаемые эффекты основных часов могут быть вторичными по отношению к опосредованным Tango10 эффектам на возбудимость/PDF. В большинстве нейронов кардиостимуляторов и во всей голове осцилляции PER и TIM в значительной степени интактны у мутантов Tango10 . Мы действительно наблюдали умеренное снижение пиковых уровней PER и более сильное снижение TIM, особенно в sLNv. Интересно, что эти фенотипы sLNv очень похожи на фенотипы, наблюдаемые после нарушений Cul3 (16). В этом предыдущем исследовании предполагалось, что CUL3 убиквитинирует TIM, направляя его на деградацию.Однако потеря предположительно разрушающего TIM Cul3 приводит к снижению пиковых уровней TIM в часовых нейронах (рис. 2 в ссылке 16), что несовместимо с прямой ролью в деградации TIM. Более того, восстановление Cul3 само по себе in vivo не изменяет убиквитинирование TIM (46).

Мы считаем, что наши данные свидетельствуют о том, что эти эффекты вместо этого связаны с повышенной возбудимостью / передачей сигналов PDF. Острое повышение возбудимости приводит к резкому снижению TIM, но не PER (47). Хроническая активация часовых нейронов LNv (через экспрессию бактериального натриевого канала NaChBac) приводит к снижению пиковых уровней CLK-активируемого фактора транскрипции PDP1 (41).Этот эффект сравним со снижением пиковых уровней PER и TIM, активированных CLK, наблюдаемым в Tango10 (рис. 3). Ранее было показано, что Cul3 необходим для зависимого от возбуждения снижения TIM (47). Одна из возможностей заключается в том, что нокдаун Cul3 , как и Tango10 , повышает возбудимость, и, таким образом, дополнительное возбуждение не может еще больше снизить уровни TIM. Кроме того, известно, что передача сигналов PDF обеспечивает обратную связь и регулирует уровни PER и/или TIM.Обнаружение того, что эффекты PDF Tango10 и Cul3 очевидны даже в tim ⁰¹ , еще больше укрепляет представление о том, что эффекты основных часов могут быть вторичным следствием его эффектов возбудимости/PDF, а не прямым воздействием на основные часы или TIM. Стоит отметить, что аллель заводского апельсина ( cwo ^B9 ) с сравнимым влиянием на амплитуду колебаний PER и TIM в sLNv сохраняет более устойчивые ритмы, чем наблюдаемые с Tango10 (54), что указывает на эффекты основных часов. недостаточно для поведенческого фенотипа.

Мы предполагаем, что основные эффекты Tango10 связаны с возбудимостью, которая, в свою очередь, регулирует уровни PDF в терминалях ( SI Приложение , рис. S12). Tango10 мутант lLNv демонстрирует повышенную скорость возбуждения, возможно, из-за снижения тока I _A . Электрическая активация LNv с помощью NaChBac или TrpA1 приводит к повышению PDF, что видно на примере снижения Tango10 или Cul3 (41, 42). Индуцированное активностью увеличение PDF может дополнительно поддерживаться высвобождением PDF и передачей сигналов обратной связи PDFR (42).

Наше обнаружение сниженных токов I _A у мутантов Tango10 предполагает, что они являются ключевой мишенью для опосредования возбудимости и поведения LNv. Уменьшение токов I _A повышает частоту возбуждения lLNv и изменяет время наступления сна (48, 55). Мы разработали вычислительную модель для lLNv, которая более точно воспроизводит активность in vivo, и эта модель демонстрирует, что изменения в I _A , наблюдаемые в Tango10 , могут объяснить повышенную частоту стрельбы. Экспрессия транскрипта Shal и текущая активность зависят от времени, достигая пика в вечерние часы, что предполагает роль в опосредовании часового контроля возбудимости нейронов (48, 50). Эти результаты согласуются с зависящими от времени эффектами ингибирования I _A в вечернее время ( SI Приложение , рис. S11). Одна из возможностей заключается в том, что экспрессия TANGO10 может усиливать токи Шала в вечернее время. Эти эффекты могут сохраняться у млекопитающих, так как снижение токов I _A также более сильно повышает скорость возбуждения ночью в супрахиазматических ядрах и изменяет циркадное поведение (56, 57).I _A также проявляет временную зависимость (58). Представляет интерес проверить гипотезу о том, что снижение тока I _A может быть результатом сниженного убиквитинирования ионных каналов Shaker/Shal или их регуляторов, возможно, за счет увеличения переноса ионных каналов и/или деградации их негативных регуляторов.

Таким образом, мы демонстрируем роль адаптера BTB TANGO10 в регуляции возбудимости LNv и передачи сигналов PDF для обеспечения циркадной ритмичности ( Приложение SI , рис.С12). Наши поведенческие, молекулярные и электрофизиологические данные подтверждают основную роль CUL3-TANGO10 в повышении текущей активности K ⁺ для снижения возбудимости. Эти эффекты на возбудимость могут, в свою очередь, регулировать передачу сигналов и уровни PDF, влияя на ритмическое поведение. Эффекты молекулярных часов могут быть нижестоящими или независимыми от изменений возбудимости. Будущие исследования потребуются, чтобы определить, играет ли CUL3/TANGO10 более широкую роль в других нейропептидергических нейронах, особенно в циркадных выходных цепях.

Материалы и методы

Дрозофила Штаммы.

Все мухи, использованные в этом исследовании, были выращены при температуре 25 °C, влажности 60 % и стандартном корме из кукурузной муки при циклах 12-часовой свет:12-часовой темноты (LD). В поведенческих анализах и иммуноокрашивании использовались самцы мух, за исключением анализов комплементации, проводимых на самках. Proteomic и Co-IP использовали смесь мужчин и женщин. w ¹¹¹⁸ (iso31) использовали в качестве штамма WT (Bloomington Drosophila Stock center, 5905). TANGO10 ^{GG GG} (также известный как Tango10 ^GG01371 ) и дефицитных штанги Tango10 были также получены из дефицитных дефицитных центров Bloomington [Stock Nos. 12775 ( Tango10 ^GG01371 ), 9171 ( д. Дф 1)ED7147 ) и 26574 ( Df(1)BSC722 )]. Фенотип ритмичности Tango10 ^GG первоначально был идентифицирован в результате скрининга предполагаемых мутаций потери функции, охватывающих 1015 генов (44). Tango10 ^bsr был выделен в рамках скрининга мутагенеза EMS, в котором потомство F1 мутагенизированных w ¹¹¹⁸ самцов X C(1)DX самок анализировали на фенотипы двигательного поведения (59). Tango10 ^GG эксцизионные штаммы были созданы с использованием транспозиции P-элемента. Следующие трансгенных мух Tango10 были получены путем инъекции эмбрионов с помощью BestGene: UAS- Tango10 (без метки), UAS- Tango10-HA и UAS- Tango10-3xFLAG.Штаммы Tango10 RNAi (штамм 103920) и UAS- Dcr2 были получены из фондового центра Vienna Drosophila . Cullin-3 RNAi был получен из Национального института генетики (NIG)-FLY Stock Center (11861R-2). elav -GAL4 (60), Pdf -GAL4 (20), тим -GAL4 (61), Clk 4.1-GAL4 (62), 30Y-GAL4 (45), 247-GAL4 (63) , элав -ГАЛ80 (64), ПДФ -ГАЛ80 (65), 247-ГАЛ80 (66), тим ⁰¹ (67), за ⁰¹ (68), за ⁰¹ (68 GeneSwitch-GAL4 (69) и da -GeneSwitch-GAL4 (70) были описаны ранее.

Локомоторный анализ мух.

Локомоторные поведенческие анализы дрозофилы проводили, как описано ранее (71). Вкратце, скрещивания и штаммы выращивали при 25 °C, и индивидуальное потомство помещали в пробирки, содержащие 1% агара, 5% корма с сахарозой, и контролировали с помощью системы DAM (монитор активности Drosophila , Trikinetics) в течение пяти циклов LD, за которыми следуют 7 циклов. г в ДД при 25 °С. Период был рассчитан по периодограмме χ ² с использованием Clocklab (Actimectrics).Ритмическая мощность отдельной мухи рассчитывалась на основе PS и усреднялась для каждого генотипа, а процент ритмичности определялся как процент мух со значением PS ≥ 10. Для скрещиваний GeneSwitch мух в возрасте от 1 до 3 дней содержали на стандарте Drosophila . пища с добавлением 250 мкМ RU486 в этаноле (EtOH) или только в EtOH в течение 5 дней. Затем мух загружали в пробирки для определения поведения агар-сахарозы, снова содержащие либо RU486, либо EtOH, и активность контролировали с помощью системы DAM.

Плазмиды.

Кодирующая область Tango10 была субклонирована из DGRC, HL07962 в модифицированный pAc5. 1 (без тегов, метки 3xHA или 3xFLAG). Затем конструкции субклонировали в pUAS-C5 для получения трансгенных штаммов. Геномный локус Tango10 , охватывающий 2969 пар оснований (п.н.) выше и 435 п.н. ниже области транскрипта, был субклонирован в вектор pCasper. Метку 3xHA клонировали между С-концом TANGO10 и 3′-нетранслируемой областью. Вектор экспрессии CUL3-V5 был описан ранее (44).

Генерация антител.

Крысиные антитела против TANGO10 были получены с использованием полноразмерного GST-TANGO10 (Cocalico Biologicals). Мышиные антитела против TANGO10 получали с использованием AKMVWGEDVP в качестве эпитопа (Abmart).

Иммуногистохимия.

Мухи в возрасте ≥5 дней были захвачены как минимум за 2 дня до вскрытия. Иммуноокрашивание проводили, как в исх. 7. Мозг мух препарировали в указанное время и фиксировали в 4% формальдегиде в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ).Образцы мозга блокировали 5% нормальной козьей сывороткой в ​​PBS, содержащем 0,3% Triton X-100 (PBS-T), в течение 30 мин при комнатной температуре. Первичные антитела разводили блокирующим раствором и инкубировали при 4 °C в течение ночи. Связывание со вторичными антителами в PBS-T проводили при 4 °C в течение ночи. Образцы монтировали с помощью VECTASHIELD (Vector Labs). Антитела, использованные для иммуноокрашивания, были следующими: мышиные анти-PDF C7 (1:800, DSHB), кроличьи анти-PER (1:200, подарок от EY Kim, Высшая школа медицины Университета Аджу, Сувон, Республика Корея), анти-TIM морской свинки [1:5000 (72)], анти-HA крысы (1:2000, Sigma-Aldrich), анти-PDF кролика (1:2000, подарок от J.Choe, Корейский передовой институт науки и технологий, Тэджон, Республика Корея). Вторичные антитела, конъюгированные с Alexa 488, Alexa 594 и Alexa 647 (Invitrogen), разводили в соотношении 1:800. Визуализация выполнялась с помощью конфокальной микроскопии с использованием системы конфокального микроскопа Nikon C2 или Zeiss LSM780.

Количественная оценка иммуноокрашивания.

Изображения были обработаны с помощью NIH ImageJ/Fiji. Конфокальные изображения проекций sLNv в дорсальных областях мозга и проекций lLNv в оптических долях были суммированы по оси z как проекция максимальной интенсивности.Интенсивность окрашивания анти-PDF выше порогового значения интегрировали из отдельных изображений с z-суммированием и усредняли для каждого генотипа. Количественную оценку PER, TIM и PDF в часовых ячейках проводили, как описано ранее (7). Арборизация PDF-позитивных проекций была количественно определена с помощью анализа Шолля с использованием Фиджи.

Культура клеток S2.

Клетки Drosophila Schneider 2 (S2-R+) ( Drosophila Genomics Resource Center), которые получены из ткани самца на поздней эмбриональной стадии Oregon R, культивировали в среде для насекомых Shields and Sang M3 (Sigma-Aldrich), содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина при 25 °C.Экспрессионные плазмиды временно трансфицировали с использованием Effectene (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Клетки собирали через 72 ч после трансфекции.

Иммунопреципитация.

Головы мух или клетки S2 лизировали в буфере Т300 [25 мМ Трис(гидроксиметил)аминометанхлорид (Tris-Cl) pH 7,5, 300 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота, 0,5% Нонидет Р-40, 1 мМ дитиотреитола и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида]. После центрифугирования тот же объем T0 (без NaCl из того же рецепта T300) добавляли к лизатам и связывали с гранулами, конъюгированными с антителами против FLAG или против V5 (Sigma-Aldrich) для 1.5 ч при 4 °C. Иммунопреципитированные белки элюировали кипячением в буфере для образцов с додецилсульфатом натрия после трех промывок.

Вестерн-блот.

Для иммуноблоттинга экстракта голов 40 голов самцов мух собирали и замораживали в указанное время. Головки гомогенизировали в буфере Т300, а образцы белков наносили на акриламидные гели. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Health), и мембраны инкубировали с крысиным анти-TANGO10 (рис. 1 и SI Приложение , рис.S4), мышиное анти-TANGO10 ( SI Приложение , рис. S5), мышиное анти-синапсин (Developmental Studies Hybridoma Bank 3C11), крысиное анти-GE-1 (73), мышиное анти-CUL3 (BD ​​Biosciences 611848), мышиные анти-V5 (ThermoFisher), крысиные анти-HA (Sigma Aldrich), кроличьи анти-PER (74), морские свинки анти-TIM (10), мышиные анти-актиновые (Developmental Studies Hybridoma Bank, JLA20) и анти- FLAG (Sigma-Aldrich) антитела. Блоты были обнаружены с использованием усиленной хемилюминесценции (GE Healthcare). Количественные оценки были выполнены с использованием изображения J из двух отдельных экспериментов ( Приложение SI , рис.С5).

Протеомика.

Трансфицированные клетки S2 и трансгенные головы мух ( tim -GAL4/UAS- Tango10 -3xFLAG, elav -GAL4/Y; UAS- Tango10 -3xFLAG/+), экспрессирующие три TANGO1-меченых и иммунопреципитацию гранулами против FLAG на ZT10 или ZT22, как в ссылке. 6, где n = 1 эксперимент на момент времени для каждого GAL4. Связанные белки элюировали с использованием пептидов 3xFLAG (Sigma). Элюированные образцы подвергали жидкостной хроматографии с анализом тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) в Северо-Западном центре протеомики.Попадания протеомики были идентифицированы в результате анализа с использованием программного обеспечения Proteome Discoverer версии 1.3 (Thermo Scientific), при этом совпадения для каждого GAL4 определялись как белки, идентифицированные в одну или обе временные точки. Белки, идентифицированные в любых контролях только для GAL4, были исключены. Белки, идентифицированные в ходе протеомного анализа FLAG-метки TWENTY-FOUR в головах мух (6), также были удалены из списка совпадений для повышения специфичности.

Электрофизиология.

Мозг взрослого самца Drosophila удаляли из головы в ледяном контрольном регистрирующем растворе (в мМ: 101 NaCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 3 KCl, 5 глюкозы, 1.25 NaH ₂ PO ₄ и 20,7 NaHCO3, pH 7,2, 250 мОсм). Соединительную ткань, воздушные мешки и трахею удаляли тонкими щипцами. Никакой ферментативной обработки не применяли, чтобы избежать удаления ионных каналов с клеточной поверхности. Затем мозг переносили в записывающую камеру и удерживали вентральной стороной вверх с помощью сетки из срезов арфы. Мозгу давали отдохнуть в непрерывно протекающем оксигенированном солевом растворе (95% кислорода и 5% углекислого газа) в течение не менее 10 минут и не более 2 часов перед записью.Перфузию оксигенированным солевым раствором продолжали в течение всего периода регистрации. Время записи используется для определения ZT.

Эксперименты по электрофизиологии всего мозга проводились на двухфотонном лазерном сканирующем микроскопе Ultima (Bruker, ранее Prairie Technologies), оснащенном гальванометрами, приводящими в действие лазер Coherent Chameleon. Флуоресценцию регистрировали с помощью фотоумножителей. Изображения были получены с помощью вертикального микроскопа Zeiss Axiovert с водно-иммерсионным объективом с числовой апертурой 40 × 0,9 с разрешением 512 × 512 пикселей и шагом 1 мкм. Запись фиксации тока и напряжения выполняли с помощью толстостенных электродов из боросиликатного стекла (1B150F-4; World Precision Instruments) с сопротивлением от 10 до 14 МОм, заполненных внутренним раствором, содержащим следующее (в мМ): 102 K-глюконат, 0,085 CaCl2 1,7, MgCl2, 17 NaCl, 0,94 EGTA, 8,5 Hepes, 4 Mg-ATP, 0,3 Tris-GTP и 14 фосфокреатин (ди-трис соль), pH 7,2, 235 Osm. Для визуализации записанной клетки во внутриклеточный раствор добавляли биоцитин Alexa Fluor 594 (10 мкМ). Записи были сделаны с помощью патч-клеммы усилителя Axopatch 200B, оцифрованы с помощью Digidata 1320 A и получены с помощью программного обеспечения pCLAMP (Axon Instruments).

Чтобы определить частоту срабатывания по данным фиксации тока, AP были обнаружены путем применения к данным медианного фильтра, после чего был применен набор биологически приемлемых пороговых значений, которые использовались для подсчета пиков в сигнале. Наиболее устойчивые пики были выбраны с использованием порога, соответствующего максимальной разности напряжений, без изменения количества обнаруженных пиков. Для оценки мембранного потенциала по данным фиксации тока применяли 10 ^-й -процентильный оконный фильтр, и мембранный потенциал оценивали как среднее значение этого отфильтрованного сигнала.

Математическое моделирование ЛНВ Электрофизиология.

Наша модель, основанная на проводимости, основана на модели электрофизиологии LNv Смита (48) и включает потенциалзависимый натриевый ток ( I _Na ), потенциалзависимый кальциевый ток ( I _Ca ) , четыре тока калия напряжения ( I _KV1 , I _KV2 , I _KV3 , и I _KV4 ), утечка натрия ( I _{утечка, NA} ) и ток утечки калия ( I _{утечка, K} ):CdVdt=Iapp-gNamNa3hNa(V-ENa)-gCamCahCa(V-ECa)-gKv1mKv14hKv1(V-EK)-gKv2mKv24(V-EK) −gKv3mKv34hKv3(V−EK)−gKv4mKv44hKv4(V−EK)−gleak, Na(V−ENa)−gleak, K(V−EK)x∞(V)=11+e−V−Vhkτx(V)=Amp ×e−V−Vmaxσ.

Калиевые каналы Shaker, Shab, Shaw, Shal являются Drosophila ортологами каналов Kv1, Kv2, Kv3 и Kv4 млекопитающих соответственно. Для модели Смита эти четыре калиевых тока были согласованы с данными фиксации напряжения из lLNv, чтобы охарактеризовать кинетические параметры, связанные с их активацией в стационарном состоянии, x∞, и константами времени, τx. Однако в модели Смита кинетические параметры токов натрия и кальция использовались без изменений из ранее опубликованной модели нейронов супрахиазматического ядра (SCN) млекопитающих (49).Моделирование модели Смита показывает расхождение с нашими записями LNv с точки зрения амплитуды и формы ПД ( SI Приложение , рис. S9), предположительно из-за неправильной кинетики натрия и кальция. Чтобы решить эту проблему, мы использовали DA, чтобы подобрать параметры токов натрия и кальция из записей LNv с токовой фиксацией. DA — это метод получения оптимальных оценок состояния и параметров динамических моделей непосредственно из наблюдений. Первоначально DA был разработан для численного прогнозирования погоды, но недавно был использован в приложениях нейробиологии (75, 76). Здесь мы использовали реализацию вариационного алгоритма DA, ранее применявшегося для подгонки моделей к данным фиксации тока от нейронов SCN (см. ссылку 77 для подробного описания нашей реализации и ее математического представления). Этот подход может одновременно оценить среднюю траекторию переменных состояния ( V , m и h ) и параметров нашей модели. Для упрощения задачи оптимизации примем более устойчивую форму кинетики скорости: ), для x=mNa, hNa,mCa, hCa .Для mCa предполагается, что постоянная времени не зависит от напряжения (т. е. τx(V)=τx0). Мы оцениваем каждый из параметров в этих уравнениях в дополнение к максимальным проводимостям gNa, gca, gleak, Na,   и gleak, K. Модель Смита имеет единственный ток утечки, но здесь мы разделяем утечку на компоненты натрия и калия как в предыдущих моделях SCN (39, 78).

В вариационном DA создается очень многомерная задача оптимизации, где каждая переменная состояния модели, параметр и момент времени добавляют одно измерение. Тот факт, что каждая включенная временная точка увеличивает размер задачи оптимизации, в сочетании с высокой частотой дискретизации (10 кГц), необходимой для экспериментов с токовой фиксацией для точного захвата сигналов AP, означает, что только относительно небольшой объем данных (несколько секунд) в лучшем случае) могут быть ассимилированы до того, как задача оптимизации станет слишком большой для решения. Чтобы увеличить количество информации, содержащейся в этих коротких окнах данных, в предыдущей работе с моделями на основе DA и проводимости использовались записи токовых клещей, выполненные со сложными изменяющимися во времени стимулами (79) или серией импульсов тока (77).В этой работе мы можем подобрать модели с DA при отсутствии входных токов для стимуляции нейрона (т. Е. Используя только спонтанную активацию). Поскольку LNv срабатывает медленно, в коротком окне данных, которое может быть использовано для DA, могут присутствовать только одна или две точки доступа из-за ограничений на размер решаемой задачи оптимизации. Таким образом, вместо того, чтобы использовать необработанную кривую напряжения в качестве данных для алгоритма DA, мы решили использовать усредненную форму сигнала AP, полученную от нескольких AP в записи с токовой фиксацией ( SI Приложение , рис.S10 А ). Мы извлекли 30 точек доступа из этой трассы и выровняли их в момент времени, когда напряжение пересекло порог всплеска -35 мВ ( SI Приложение , рис. S10 B ). Затем мы рассчитали средний мембранный потенциал на этих выровненных точках доступа в каждый момент времени для окна в 350 мс до и 400 мс после пересечения порога. Эта средняя форма волны AP затем использовалась в качестве данных (наблюдений) для нашего алгоритма DA. Использование средней формы волны АД ​​в качестве наблюдений является вкладом в методологию DA для построения моделей медленных спонтанно возбуждающихся нейронов.Мы запустили наш алгоритм DA, начиная с более чем 100 различных начальных условий, чтобы выбрать параметры для модели WT ( SI, Приложение , рис. S9 и таблица S8). Код MATLAB для моделирования модели доступен в ModelDB (https://senselab.med.yale.edu/modeldb/).

Доступность данных

Данные протеомики масс-спектрометрии были переданы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE с идентификатором набора данных PXD029326.

Благодарности

Мы благодарим Joonho Choe, Eun Young Kim, Bloomington Drosophila Stock Center, Vienna Drosophila Stock Center, NIG-FLY Stock Center, Drosophila Genomics Resource Center и Developmental Studies Hybridoma Bank за реагенты; Основной центр Northwestern Proteomics для анализа ЖХ-МС/МС.Работа выполнена при поддержке грантов NIH (гранты R01NS106955, R56NS052903 и HL7909-19) и Агентства перспективных оборонных исследовательских проектов (грант D12AP0023 [RA]), Национального исследовательского фонда Республики Корея (грант NRF-2019R1I1A1A01063087 [JL] ; Грант NRF-2021M3A9G8022960 [CL]), NSF (Грант DMS 1555237) [COD], Департамент сухопутных войск — Материальное командование (грант W911NF1610584 [RA, WLK и COD]) и Инициатива по исследованию аутизма Фонда Саймонса ( Грант 735135).